祁永清 李菊英 贺菊香 张梦岚

    高原缺氧的恶劣环境，导致机体发生一系列机能和形态的变化，胃肠道对缺氧较为敏感，可引起胃黏膜出血、胃溃疡等消化系统疾病。在高原低氧地区胃黏膜出血、胃溃疡、慢性萎缩性胃炎比平原地区高发。胃癌是高原地区常见的恶性肿瘤之一，发病趋于年轻化，而且大部分患者来就诊时就已进入了中晚期，失去了最佳的治疗机会，是一种严重威胁高原地区人民生命健康的主要疾病。胃癌的发生是多因素参与的多阶段、多步骤过程，导致细胞过度增生、异常分化、细胞凋亡减少而形成的。选择特异性性抗体，对胃癌早期诊断及胃癌细胞生物学的影响和胃癌患者的预后评估有着重要的意义。

    1 材料与方法

    1.1 材料 收集2010年7月至2011年5月青海大学附属医院及青海省人民医院送检病理科的胃癌切除标本60例，男38例，女22例;年龄35～80岁，平均55.7岁;高分化10例，中分化21例，低分化29例;淋巴转移33例，无转移27例。取正常体检并本人自愿情况下的正常胃黏膜2～4块，共10例。年龄28～74岁，平均年龄(47±8)岁。上述标本，留取部分-80℃保存以备提取RNA，部分经10%中性甲醛固定48 h，常规脱水、透明和包埋，连续切片，厚度为4μm，HE常规染色诊断，符合实验要求的组织蜡片置于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片烤干备用。

    1.2 试剂 THBS4一抗为兔抗人多克隆抗体，购自美国GENETEX公司。即用型第二抗体A、B液、柠檬酸抗原修复液、PBS工作液、浓缩型DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。RT-PCR试剂:Trizol试剂(购自北京赛百盛公司)、RT-PCR试剂盒(购自美国Promega公司)、100bpDNA marker(购自上海生物工程公司)、PCR引物(购自上海生物工程公司)、琼脂糖(购自上海GeneTech公司)、Tfis碱(购自美国Sigma公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 免疫组化S-P法检测THBS4蛋白的表达:石蜡切片(4μm)、37℃烤片过夜、二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ脱蜡30 min、100%、95%、90%、85%、80%乙醇依次水化5 min、PBS洗3次×5 min、柠檬酸高压抗原间接修复10 min、自来水中放置高压锅降温 ......