王莹 刘玉刚 陈占法

    脑组织代谢旺盛，血流量丰富，因此脑缺血极易引起神经细胞损害，致功能缺失。缺血、缺氧条件下，神经元产生大量自由基，同时钙离子(Ca2+)超载，损伤线粒体，从而诱导神经元凋亡[1]。梓醇是一种环烯醚菇类的小分子化合物。研究表明，能促进PC12细胞轴突生长、保护海马神经元等[2，3]。文献报道连二亚硫酸钠联合无糖Earle’s液损伤模型能较好地反映神经细胞缺糖缺氧损伤[4]，本研究以PC12细胞为基础建立该模型，考察梓醇的干预作用，并从拮抗自由基损伤和减轻Ca2+超载探讨其作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)购自中科院上海细胞库;梓醇购自上海同田生物技术公司，纯度≥97%;连二亚硫酸钠、RPMI1640培养基、噻唑蓝MTT、胎牛血清均为 Gibco公司产品;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物公司。

    1.2 方法

    1.2.1 PC12细胞培养及分组:PC12细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。细胞经0.05%胰蛋白酶消化传代后置含5%CO2的37℃培养箱内培养，取对数生长期的细胞进行实验。实验共分5组:正常对照组:不加任何药物;缺糖、缺氧损伤组:加入终浓度含0.5 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle’s液;梓醇高、中、低剂量组:梓醇终浓度分别为 10、1、0.1μmol/L，各浓度梓醇预处理细胞24 h后，加入连二亚硫酸钠损伤，1 h后进行指标检测。

    1.2.2 MTT法检测细胞存活率:细胞以1×105个/ml接种于96孔板，每孔100μl。12 h后，按照实验分组给予处理。检测时每孔加5 mg/ml MTT溶液15μl，继续培养4 h，弃上清后每孔加入150μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪在492 nm波长下测定各孔吸光度值(OD值)。细胞存活率(%)=处理组OD值/对照组OD值×100%。实验重复3次。

    1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测:细胞以4×105个/ml接种于24孔板，每孔500μl。12 h后，按照实验分组给予处理。检测时，按照试剂盒说明书进行操作。LDH释放率(%)=上清LDH活性/(上清LDH活性+细胞溶解液LDH活性)×100% ......