张哲 王超

    ·论著·

    过表达KLF4对棕榈酸所致L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响

    张哲 王超

    目的 探讨Krüppel样因子4 (KLF4)过表达对大鼠L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响。方法采用棕榈酸诱导法建立大鼠L6骨骼肌细胞的胰岛素抵抗模型，随机分为对照组和转染组。对照组转染腺病毒空载体(Ad)，转染组转染KLF4腺病毒表达载体(Ad-KLF4)。采用Real-time PCR和Western-blot检测两组KLF4、胰岛素受体(IR)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达水平，采用葡萄糖氧化酶法检测两组培养液中的葡萄糖浓度。结果与对照组比较，棕榈酸诱导组对葡萄糖的摄取量显著降低(P1 材料与方法

    1.1 材料 L6细胞株(中国协和医科大学细胞中心)；α-MEM、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；葡萄糖氧化酶试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；多克隆抗体(美国Sigma公司)。Lipofectamin 2000、RT-PCR相关试剂(美国Promega公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养、胰岛素抵抗模型的建立和鉴定5% CO2、37℃饱和湿度条件下,将复苏后的大鼠L6肌细胞接种在含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的α-MEM培养基中培养。2 d后更换含2% FBS的α-MEM培养基进行诱导培养，每天换液1次，直至细胞长出肌管。细胞消化后转入24孔板(1×106个/孔)，随机分为对照组和诱导组。对照组加入正常α-MEM培养基，诱导组加入含0.3 mmol/L棕榈酸的α-MEM培养基，培养24 h。两组细胞用预冷PBS洗涤2次，先加入含100 ng/ml胰岛素的正常培养基孵育30 min，再加入5.6 mmol/L葡萄糖孵育24 h。采用葡萄糖氧化酶法测定细胞上清液中葡萄糖浓度。

    1.2.2 重组腺病毒转染将大鼠全长KLF4 cDNA序列克隆到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中。酶切和测序鉴定后，将空载体病毒及重组腺病毒利用Lipofectamin 2000脂质体转染A293细胞，包装、扩增后得到重组腺病毒质粒Ad-KLF4 ......