潘坤 张泽明 赵学琴 冯欣

    ·论著·

    低氧诱导因子1-α的表达及DNA结合活性在非小细胞肺癌中的临床意义

    潘坤 张泽明 赵学琴 冯欣

    目的探讨非小细胞肺癌患者肺组织中HIF-1α的表达及DNA结合活性的动态变化与肿瘤病理学特性的关系。方法收集89例非小细胞肺癌患者肿瘤及癌旁正常肺组织标本，RT-PCR检测HIF-1α的mRNA表达水平，Western blot检测HIF-1α的蛋白质表达水平，EMSA法检测HIF-1α DNA结合活性的表达变化，并结合临床及病理特征进行分析。结果HIF-1α mRNA及蛋白的表达水平在肿瘤组织中均明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P1 资料与方法

    1.1 一般资料 本研究选取我院2010年7月至2012年4月经手术切除的并经病理确诊的非小细胞肺癌患者为研究对象，收集89例患者肺癌组织、癌旁正常肺组织(距离肿瘤边缘>5 cm以上)标本进行试验。所选患者术前均未行化疗、放疗、介入及中医中药等抗肿瘤治疗，有完整的病例资料。其中男54例，女35例；年龄37～64岁，平均年龄58岁。其中有淋巴结转移组51例，无淋巴结转移组38例；TNM：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。临床分期标准：按照第七版美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)制订的TNM分期标准分类。Western blot检测所用的肿瘤肺组织及癌旁正常肺组织切除后立即置于-70℃冰冻保存。

    1.2 实验方法 RT-PCR：使用由上海生物工程公司合成的扩增引物，严格按照该公司TRIZOL试剂使用说明书进行试验，提取总RNΑ，逆转录之后行PCR，得到RT-PCR产物后应用琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物条带行吸光度半定量分析。反应循环参数：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，32循环后72℃延伸10 min。检测基因HIF-1α和内参照物β-αctin的引物序列分别为：HIF-1α (433 bp)上游：5’-GCCCCTΑCTΑTGTCGCTTTC-3’，下游：5’-GGCCCΑΑΑCTΑΑΑCTΑTCTGΑ-3’；β-αctin(635bp)上游：5’-CCTΑΑGGCCΑΑCCGTGΑΑ-3’，下游：5’-CTΑGGΑGCCΑGGGCΑGTΑΑTC-3’。

    Western blot：0.1 g肺组织剪碎加入RIPΑ 裂解液，冰浴匀浆，4℃ 10 000 g离心，将沉淀去除后得到肺组织总蛋白，将蛋白样本稀释成相等浓度分装，置于- 80℃冰冻保存 ......