董长征 赵文清 李文玲 岳向勇 孔艳莉 康进生 梁传栋 王蕴欣

    大鼠海马神经元癫痫样放电模型的构建

    董长征 赵文清 李文玲 岳向勇 孔艳莉 康进生 梁传栋 王蕴欣

    目的探讨“无镁细胞外液”诱导体外培养大鼠海马神经元产生癫痫样放电的可行性，以期建立难治性癫痫离体细胞模型。方法选取24 h内新生Wistar大鼠，分离海马神经元后进行原代培养，体外培养至第12天时，用“无镁细胞外液”处理3 h，应用全细胞膜片钳技术记录海马神经元的放电情况。结果在培养第12天时，神经元突起间彼此接触形成神经网络。在“无镁细胞外液”处理3 h后神经元产生稳定的放电，恢复正常细胞培养液培养24 h，神经元仍可检测到自发的“癫痫样放电”。结论体外培养第12天海马神经元，在“无镁细胞外液”处理后可形成稳定的自发性癫痫样放电，为今后在细胞分子水平研究癫痫发病机制提供了一种理想模型。

    海马;神经元;膜片钳;癫痫样放电;动作电位;原代培养

    药物难治性癫痫是神经科常见病之一，其发病机制目前尚不十分清楚，既往研究多来源于完整脑组织切片，遗传模型以及培养神经元模型，每一种癫痫模型都有其自身的优势和不足;除非使用药物或电刺激，否则很难形成一个反复自发性癫痫模型[1]。体外培养的单纯神经元环路被认为适合用于进行复杂生物物理以及药理遗传学的研究来理解病理状态下癫痫的传播和维持。然而，尽管已经有能力在培养的微小神经元上诱发出药理学意义上的癫痫样活动[2]，但在培养神经元中产生持久的自发性反复性癫痫发作尚困难重重。本研究拟将体外培养第12天的大鼠海马神经元，用“无镁细胞外液”处理3 h，用全细胞膜片钳技术检测神经元动作电位的变化，建立海马神经元癫痫样放电模型，为进一步研究癫痫发病机制以及神经肽Y药物干预提供理想的细胞模型。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 新生24 h内Wistar大鼠20只，由英国利兹大学生物系实验动物中心提供。饲养环境温度20～23℃，湿度45% ～50%，清洁级。

    1.2 主要试剂 Neurobasal TM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、L-多聚赖氨酸、B27、D-Hanks液、胰蛋白酶为GIBCO公司制品;氯化镁(MgCl2·6H2O)分析纯为英国Fisher Scientific公司;正常细胞外液组成成分(mmol/L):NaCl 147，HEPES 10，Glucose 13，KCl2，CaCl2，MgC12;用 5 mmol/L NaOH 调节 pH 值至7.3，调整渗透压为280～320 mmol/L ......