刘苏健 范波 丁明超 王意忠 王斌

    近年来，动脉硬化及其闭塞性血管疾病的发生率迅速升高，自体静脉移植是治疗外周血管疾病的有效手段。然而移植血管中膜平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向内膜迁移、过度增殖和细胞外基质大量合成是导致血管移植术后移植静脉内膜增厚、管腔狭窄的重要原因[1]。如何防治血管内膜增生一直是困扰血管外科医师的临床难题。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是在转录后水平使得靶基因mRNA降解，从而使得目的基因表达减少或沉默[2]。本研究针对PI3K-Akt-mTOR信号通路中关键信号因子Akt亚型Akt1进行RNA干扰，通过分子生物学技术观察其抑制平滑肌细胞增殖的效果。

    1 材料与方法

    1.1 实验试剂与仪器 质粒pGenesil-1和感受态大肠杆菌DH-5α购自武汉晶赛生物技术有限公司，Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司，DMEM培养基(Dulbcco's Modified Eagle Medium)和新生牛血清购自美国Gibco公司，限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、PstⅠ和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司，质粒小提试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Annexin V-PE购自Bender Medsystems公司。

    1.2 方法

    1.2.1 基因序列:利用Invitrogen网站(www.invitrogen.com)提供的设计工具设计目的靶基因兔Akt1 mRNA序列，依照shRNA设计原则，设计并合成4条shRNA片段，退火形成双链后进行酶切和测序，经预实验后挑选出2条有效地Akt1 shRNA真核表达载体，一条为5’-GGGACUAGACCAUAAUCCATA-3’，另外一条为5’-CCTGGCUGACUUGAAUAUGTT-3’，阴性对照(错配质粒shRNA)序列为5’-UUAGACCUCTGGUUCGUACTT-3’ ......