何伟 李英 胡志娟 马云娜 高占红

    糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病机制复杂，主因是肾血流动力学及非血流动力学两大因素综合作用的结果，涉及到肾素-血管紧张素、降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide，CGRP)、内皮素-1(endothelin，ET-1)等多种血管活性肽类物质的相互作用。本研究应用糖尿病大鼠模型，观察CGRP和ET-1在糖尿病大鼠肾组织的表达情况以及氯沙坦对两种肽类物质的影响。

    1 材料与方法

    1.1 糖尿病大鼠模型的建立和分组 选取体重120～150 g健康雄性Wister大鼠(河北医科大学实验动物中心供给)42只，随机分成对照组、糖尿病组及氯沙坦组，每组14只。糖尿病组和氯沙坦组大鼠腹腔一次性注射链尿佐菌素(溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液，pH值4.5)65 mg/kg，72 h后取尾静脉血，测血糖 >16.65 mmol/L(美国强生One TouchⅡ血糖仪测定)，表明造模成功;正常对照组大鼠以等量枸橼酸缓冲液一次性腹腔注射。氯沙坦组大鼠给予氯沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，对照组和糖尿病组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。实验期间大鼠自由进食、进水，不使用胰岛素及其他降糖药，每天测体重1次。于实验第8周处死3组动物，处死前1 d采用代谢笼留取24 h尿液，测24 h尿蛋白定量;处死当天股动脉取血，分离血清测血糖、尿素氮、肌酐;取双肾去包膜称重。取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学检测;部分肾组织提取总RNA。

    1.2 光镜观察及图像分析 肾组织石蜡切片，HE染色，光镜观察。每张切片随机选取20个肾小球，用自动图像分析仪计算其平均截面积(average sectional acreage，AG)，并根据公式1.38/1.1(AG)3/2计算平均体积(average volume，VG)。

    1.3 免疫组织化学染色 采用SABC法:石蜡切片经二甲苯及乙醇脱蜡，滴加3%过氧化氢孵育5 min，以灭活内源性过氧化物酶;蒸馏水冲洗3次，每次2 min，0.01 mol/L PBS浸泡5 min，10 mmol/L的枸橼酸钠微波抗原修复10 min;自然冷却后，加10%正常山羊血清封闭液室温封闭10 min;倾去封闭液后滴加1∶100稀释的一抗(兔抗小鼠CGRP和ET-1抗体) ......