郝桂敏 崔娜 李学慧 李茜

    ·论著·

    蛋白激酶C参与内源性大麻素花生四烯乙醇胺对L型钙电流的抑制作用

    郝桂敏 崔娜 李学慧 李茜

    目的研究内源性大麻素物质花生四烯乙醇胺是否通过改变蛋白激酶C(PKC)活性从而抑制心肌L型钙电流，并进一步探讨可能改变PKC活性的信号途径。方法应用全细胞膜片钳技术记录单个心肌细胞的L型钙电流(P1 材料与方法

    1.1 大鼠心室肌细胞的分离 参照我室以前文献[2]，取健康雄性大鼠，体重200～250 g，由河北医科大学实验动物中心提供。将大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，迅速开胸取出心脏，置于4℃台氏液中，游离主动脉并逆行插管连接于Langendorff灌流装置上，台氏液4 ml/min流速连续灌流约5 min，洗去心脏残血，然后用无钙台氏液灌流约10 min至心脏停搏后，用含300 mg/L胶原酶Ⅱ的无钙台氏液灌流分离大鼠单个心室肌细胞，消化约10 min后自左心室分段剪取心室肌组织，置于盛有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使之分散成单个细胞，置于4℃冰箱稳定1 h待用。其中一部分细胞用于膜片钳实验，另一部分细胞用于其他实验。

    1.2 膜片钳全细胞记录 参照我室以前文献[2]，在室温下应用全细胞膜片钳技术记录单细胞离子电流。所用微电极用两步拉制法拉制而成，制成的微电极充灌电极液后电阻2～4 MΩ。实验过程由计算机软件pCLAMP 10.0(AxonInstrument)控制数-模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。实验时，将细胞悬液滴入浴槽中(容积1 ml)，静置5～10 min待细胞贴壁后，用记录L型钙电流的细胞外液以1 ml/min恒速灌流。选择横纹清楚，边缘整齐，表面光洁的杆状心室肌细胞在电压钳模式进行刺激和记录L型钙电流。 封接和破膜时均进行电容电流补偿，信号输入经过1 kHz的滤波，数据存于计算机以便分析。灌流过程中，细胞外液加入内源性大麻素物质花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)观察L型钙电流变化；应用CB1受体阻断剂AM251(100 nmol/L)，CB2受体阻断剂AM630(100 nmol/L)或PKC非特异性激动剂PMA(500 nmol/L)首先灌流5 min后再加入花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)，观察L型钙电流变化。

    1.3 PKC活性检测 将上述分离的心肌细胞置于台式液中，在台式液中加入花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)孵育10 min；或用AM251(100 nmol/L) ......