张萌 黄刚 周志刚 杨金良

    胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃、肠内容物反流至食管引起的各种症状或食管黏膜组织损伤，是胃肠道的常见疾病之一。反流可引起烧心、反酸、胸痛甚至哮喘、咳嗽等症状，易长期反复发作且治疗效果欠佳，严重影响患者的生活质量。临床研究表明，奥美拉唑对反流性食管炎(RE)有一定的疗效[1-3]，但对其作用机制报道较少。本研究应用反流性食管黏膜损伤大鼠模型，观察了奥美拉唑对反流食管黏膜损伤的作用，同时观察了其对增殖细胞核抗原(PCNA)、肿瘤抑制基因(p21)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cylin-dependentkinases，CDK)4表达的影响，进一步探讨了其作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 动物分组 健康雄性SD大鼠75只，体重220～250 g，由河北省实验动物中心提供。大鼠购入后适应环境1周，分笼饲养，自由进食标准饲料及饮水。随机将大鼠分为5组:假手术组、胃食管反流动物模型组(模型组)、奥美拉唑低、中、高剂量组，每组15只。

    1.2 模型制备及给药 术前大鼠禁食24 h，禁水2 h。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30 ml/kg)麻醉，采用食管下段与胃底吻合术，上腹部正中切口，于胃大弯侧食管下段(距胃食管交接部0.5～1.5 cm处)和胃底近食管下段处分别做1.0 cm切口行侧侧吻合。假手术组上腹部正中切口，暴露胃食管及十二指肠于腹腔外约10 min后关闭腹腔。于术后第6天分别将奥美拉唑低剂量(10 mg)、中剂量(20 mg)、高剂量(40 mg)给大鼠灌胃，假手术组和模型组大鼠给予等容量的0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。取食管下段(包括吻合口)进行纵行剖开，肉眼观察黏膜状况，迅速分为两份，一份放入液氮罐内冰冻保存行免疫组织化学检测。另一份呈条状置于10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色，光镜观察组织学改变。

    1.3 免疫组织化学检测 p21，PCNA，CyclinD1，CDK4蛋白表达 各例石蜡包埋组织均取6张切片，4张分别进行蛋白免疫组织化学染色，1张用PBS液代替一抗作为阴性对照，1张备用。用已知阳性切片作为阳性对照。所用载玻片均经多聚赖氨酸处理，连续切片厚4 μm，一抗为小鼠抗人p21单克隆抗体(稀释比例1∶50)，小鼠抗人CDK4单克隆抗体(稀释比例1∶50)、兔抗人CyclinD1单克隆抗体(稀释比例1∶50)、兔抗人PCNA单克隆抗体(稀释比例1∶100)、二抗为生物素化羊抗兔或小鼠 IgG ......