李建强 张宏蕊 石晓明 吕柏楠

    ·论著·

    水通道蛋白-8对结肠癌细胞凋亡及凋亡抑制蛋白的影响

    李建强 张宏蕊 石晓明 吕柏楠

    目的通过表达水通道蛋白-8(AQP-8)真核表达载体，观察水通道蛋白AQP-8对HT-29细胞凋亡及凋亡抑制蛋白(IAPs)表达的影响。方法取对数生长期的人结肠癌HT-29细胞株用于实验。构建AQP-8真核表达载体并转染HT-29细胞，通过Western blot检测GFP-AQP-8转染效率；采用MTT法检测各组细胞增殖抑制率；流式细胞术检测细胞凋亡率；通过Real Time-PCR和Western blot检测转染GFP-AQP-8的HT-29细胞凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin和Livin表达水平。结果Western blot结果显示，GFP-AQP-8转染后结肠癌HT-29细胞AQP-8基因表达显著上调(P1 材料与方法

    1.1 实验材料 结肠中分化腺癌细胞株HT-29，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。MTT，美国Sigma公司；DMEM/F12培养液、胰蛋白酶，Gibco公司；荧光定量RT-PCR试剂盒，美国Promega公司；ABI 7500 PCR仪，美国ABI公司；AQP-5、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin及GAPDH抗体，美国Santa Cruz公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；FASCalibur流式细胞仪，BD公司。

    1.2 实验方法

    1.2.1 细胞培养：人HT-29细胞于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素的DMEM/F12培养基中培养，于37℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中孵育。用0.25%胰蛋白酶溶液消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。

    1.2.2 GFP-AQP-8转染和实验分组：用软件设计AQP-8基因特异性引物，提取HT-29细胞总RNA，采用RT-PCR法扩增AQP-8基因，与质粒载体GFP-N1进行酶切、链接，经过转化、筛选、鉴定并测序。转染前24 h于6孔板中接种HT-29细胞，密度为4×106个/ml。转染前用无血清无抗生素的DMEM/F12清洗细胞，经脂质体介导法，按照试剂说明书用转染试剂LipofectamineTM 2000将GFP-AQP-8或对照质粒GFP-N1转染HT-29细胞。转染24 h后，检测转染效率及PCNA和P53表达 ......