张涛 张胜逆 李靖华 张爱民 杨季红 程树杰

    先天性肛门直肠畸形(anorectal malformations，ARM)是小儿常见的消化道畸形，ARM发生的病理机制十分复杂，许多学者对动物和人类胚胎肛门直肠正常以及异常的发育过程进行了研究，目前仍没有完全阐明正常肛门直肠胚胎发育的演变规律，对ARM具体的胚胎发生机制更是知之甚少[1-3]。胚胎期肛门直肠的形态演变和构型改变依赖于细胞定向分化、增殖及细胞凋亡的协同作用。前人研究显示，在小鼠肛门直肠的胚胎发育过程中，细胞增殖(凋亡)在泄殖腔分离、肛膜及尿生殖膜崩解中发挥了重要作用[4，5]。而细胞增殖(凋亡)是否也参与了人类肛门直肠的发育，至今未见相关研究报道。本研究应用3～9周人胚标本，结合PCNA免疫组织化学及TUNEL技术染色分析细胞增殖(凋亡)的时空分布规律，初步探讨细胞增殖(凋亡)在肛门直肠胚胎发育中的作用。旨在更深入地认识肛门直肠胚胎发育过程，为进一步阐明ARM的发生提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 标本与试剂 本研究遵守赫尔辛基宣言，收集因意外妊娠而进行人工流产，发育正常的人胚胎标本108例(每例标本均取得产妇本人同意)。根据产妇末次月经时间、Carnegie stages人胚胎形态发育特征和超声所测胎儿头臀长、双顶径等确定胎龄为3～9周。标本经4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液4℃固定12～24 h，常规脱水制成蜡块，行矢状面连续切片。见表1。

    表1 不同胎龄的标本分布

    1.2 方法 3～5周胚胎取整个胚胎，6～9周胚胎取其盆部，标本经0.01 mol/L PBS液冲洗后立即置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定12～24 h，常规脱水，石蜡包埋。石蜡标本进行矢状面连续切片，厚度4 μm，在显微镜下观察未染色切片，在观察到泄殖腔或直肠膀胱出现时连续保留切片，连续切片TUNEL和PCNA的免疫组化染色，免疫组化实验采用SP法。Nikon E800成像系统拍照。采用NIS-Elements Basic Research多媒体彩色病理图像分析系统连续对比观察不同胎龄人胚的泄殖腔、尿直肠隔、直肠、膀胱和尿道发育情况及其相互间的关系。对TUNEL、PCNA的表达进行定位观察分析，每张切片分别观察40倍，100倍及400倍视野图像，来判定阳性细胞的分布区域及大体变化趋势 ......