刘晓鹏尚丹

    作者单位: 050000石家庄市，北京铁路局石家庄卫生防疫站

    常用分子生物学技术在食品病原微生物检测中的应用

    刘晓鹏尚丹

    作者单位: 050000石家庄市，北京铁路局石家庄卫生防疫站

    【关键词】聚合酶链式反应;实时定量PCR;环介导等温扩增法;基因芯片;酶联免疫吸附

    E-mail: 87553831@ qq.com

    食品微生物检测对于保障食品安全起着及其重要的作用。传统的微生物检测方法虽然有效，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题，难以满足现代社会快速检测的要求。随着细菌基因组学和分子生物学技术的飞速发展，诞生了许多分子生物学技术，它们因准确度和灵敏度高、特异性强、操作简便、检测周期短、效率高等优点，越来越被广泛应用。本文对在食品病原微生物检测中常用的几种分子生物学技术原理及应用作一综述。

    1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)

    1.1PCR原理美国人Mullis于1985年发明了PC技术，并荣获了1993年诺贝尔化学奖。PCR现在已成为生命科学领域最常用的分子生物学技术之一，它是一种体外酶促合成DNA片段方法，由变性、退火和延伸等几步反应组成一个循环，重复进行，最终使目的DNA以指数级迅速扩增。

    常规PCR反应体系中包括模板、引物、Taq DN聚合酶、dNTP、Mg2+及缓冲液等成分。PCR反应的原理类似于DNA的天然复制，其一轮循环过程如下(1)变性，即在93～95℃高温下，是双链DNA解离形成单链; (2)退火，即在合适的温度下，引物与单链DNA模板的特异区域配对结合; (3)延伸，即在72℃下，Taq DNA聚合酶以引物的3’末端作为起始，以dNTP作为底物，按碱基互补配对原则，合成一条模板DNA链互补的新链。如此重复30个循环左右，目的基因就会被扩增一百万倍以上。

    PCR技术中，引物的设计质量起到至关重要作用。在使用软件进行引物设计时，一般要遵循以下基本原则: (1)引物长度一般为18～30 nt; (2) GC含量为40%～60%，碱基尽可能随机分布; (3)避免引物本身或引物之间形成发夹结构或引物二聚体; (4)引物3’端的碱基要求严格配对，3’末端尽量不要以A结尾。

    与传统的微生物检测方法相比，PCR具有特点: (1)灵敏度高:病毒检测的灵敏度可达3个RFU，细菌检测的最小检出率为3个细菌; (2)特异性强:对不同微生物型进行准确鉴定; (3)操作简便省时:一般1～2 h就可完成检测 ......