张黎明

    骨肉瘤是好发于儿童和青少年的常见恶性骨肿瘤，手术及新辅助化疗是其主要治疗手段，但肿瘤早期肺转移及部分患者对化疗耐药是造成综合治疗效果不佳、患者死亡率高的主要原因[1]。研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)在骨肉瘤等多种恶性肿瘤组织高表达，是目前发现的诱导肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞增殖和转移的关键基因[2]。因此，针对阻断肿瘤血管形成的基因靶向治疗对于控制肿瘤局部浸润及远处转移、提高患者生存率具有重要治疗价值。重组人血管内皮抑制素(rhEndo)是已知具有抗肿瘤作用的血管生成抑制因子[3]，本研究以骨肉瘤MG-63 细胞为研究对象，旨在观察rhEndo 对VEGF 蛋白表达、细胞增殖、凋亡及迁移的影响，为进一步探讨rhEndo 治疗骨肉瘤的作用机制提供理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂 人骨肉瘤MG-63 细胞购自中科院上海细胞研究所;兔抗人VEGF 单克隆抗体、鼠抗人βactin 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司;牛血清白蛋白(BSA)、DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO 公司;CCK-8 试剂盒购自武汉博士德公司。RT-PCR 试剂盒购自美国Promega 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养:在37℃、5% CO2培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基常规培养人骨肉瘤MG-63 细胞，每2 ～3 天更换1 次培养基，当细胞生长至合适汇合时用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 消化分散细胞，进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。

    1.2.2 RT-PCR:Trizol 提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA 纯度和浓度。取1 μg 总RNA 用RTPCR 试剂盒反转录成cDNA，以此为模板进行后续PCR 扩增。PCR 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，引物序列见表1。扩增完毕后取5 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪对条带进行扫描分析，以VEGF 与β-actin 灰度值的比值来反映VEGF mRNA 表达水平。

    表1 VEGF、β-actin 引物序列

    1.2.3 Western blot:提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，定量上样进行10% SDS-PAGE 凝胶电泳 ......