张黎明

    骨肉瘤是好发于青少年的最常见骨恶性肿瘤，侵袭性强，易发生早期肺转移，导致患者病情进展迅速，预后差[1]。研究显示，凋亡抑制蛋白Livin在骨肉瘤等多种恶性肿瘤组织高表达，不仅参与肿瘤的增殖和凋亡进程，而且与肿瘤细胞的侵袭、转移及对化疗药物的敏感性密切相关[2]。然而，关于 Livin及血管内皮生长因子(VEGF)在骨肉瘤组织表达的相关性及与肿瘤转移、预后的关系目前笔者尚未见明确报道。本研究通过检测骨肉瘤组织Livin、VEGF的表达及与临床病理参数的关系，分析二者表达的相关性，探讨其在骨肉瘤转移及预后中的作用。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 选取我院2011年10月至2013年10月经手术切除的骨肉瘤组织蜡块标本58例，术前均未接收任何放化疗，经临床﹑影像﹑病理确诊为骨肉瘤，临床病理资料完整。其中男32例，女26例;年龄8～46岁，中位年龄19.4岁。Dahlin病理分型:骨母细胞型20例，纤维母细胞型22例，软骨母细胞型16例;肿瘤部位:股骨20例，胫腓骨18例，肱骨10例，其他部位10例。Enneking临床分期:ⅠA期0例，ⅠB期4例，ⅡA期11例，ⅡB期28例，Ⅲ期15例;有软组织浸润40例，无软组织浸润18例;有肺转移48例，无肺转移10例。另选取同期骨软骨瘤组织标本35例作为对照，其中男19例，女16例;年龄11～49岁，中位年龄22.3 岁。

    1.2 主要试剂 兔抗人Livin单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体购自 Santa Cruz公司。Trizol、RTPCR试剂盒购自美国Promega公司。免疫组化SP试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司。

    1.3 实验方法

    1.3.1 RT-PCR:采用 RT-PCR 技术检测 Livin、VEGF mRNA表达，Trizol提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。取1 μg总RNA用RT-PCR试剂盒反转录成cDNA，以此为模板进行后续PCR扩增。PCR引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。扩增完毕后取5 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪对条带进行扫描分析，以目的基因与β-actin灰度值的比值来反映目的基因mRNA表达水平。见表1。

    表1 Livin、VEGF、β-actin 引物序列 ......