徐袁秋 刘思源 张卫华 刘星 林亮 许新明

    骨肉瘤是最常见的原发于骨组织的恶性肿瘤，好发于青少年，易发生早期肺转移，预后较差，是严重危害青少年健康的恶性肿瘤之一。对化疗有一定的敏感性。目前对骨肉瘤患者多采用以吡柔比星、顺铂、甲氨蝶呤和异环磷酰胺等综合化疗方法。关于具体的用药方法和作用机制并未作深入的研究。本实验旨在对吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺等药物对骨肉瘤细胞株(MG-63)的细胞毒性及分子作用机制，为临床应用提供实验依据的同时指导临床用药。

    1 材料与方法

    1.1 材料 人成骨肉瘤细胞株(MG-63)取自河北医科大学第三医院综合实验中心;吡柔比星为深圳万乐药业有限公司产品;顺铂(批号:8090162DB)、卡铂(批号:8110172ES)为齐鲁制药有限公司产品;甲氨喋呤(批号:08082511)、异环磷酰胺(批号:08062811)为江苏恒瑞医药有限公司产品;无支原体胎牛血清为杭州四季青生物制品厂产品;使用的其他材料包括 MTT、DMEM培养基、二甲基亚砜、EDTA、胰蛋白酶、细胞培养瓶、48孔培养板、0.22 μm微孔虑膜及加样器。

    1.2 方法

    1.2.1 在 37℃、5%CO2、95% 空气、饱和湿度下 CO2孵箱内闭式传代培养细胞，将传代后第3天处于指数增殖期细胞经EDTA和胰酶消化制成悬液后分别接种到3个48孔板上，每孔加90 μl的细胞悬液(细胞浓度为1.5×104/ml)和10 μl的药物。加入不同浓度的药物，培养的时间分别为24、48、72 h。利用倒置显微镜观察细胞的形态。

    1.2.2 经上述处理，分别在 24、48、72 h 后加 MTT 10 μl/孔，继续培养4 h，在平板离心机上离心10 min，2 000 r/min，弃上清液，加二甲亚砜 150 μl/孔，待结晶溶解后，用全自动酶标仪(波长690 nm)测定每一孔的吸光度 A值(OD值)，并计算其细胞毒性指数值(CI)，CI=(对照组A值-试验组A值)/对照组A值×100%。利用MTT法制作药物浓度时间曲线。

    1.2.3 利用流式细胞仪进行细胞周期的分析。将浓度为0.4×106/ml的细胞悬液12 ml和不同浓度的吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺共同置于75 cm2的培养瓶分别培养24、48和72 h后将培养液连同用EDTA和胰蛋白酶消化下的骨肉瘤细胞一起离心、清洗 ......