耿乐乐 陈彦平

    肿瘤的发生发展不仅与细胞增殖有关，亦与细胞凋亡有关，而后者的作用更为重要，化学药物和放疗杀死肿瘤细胞都是通过诱导细胞凋亡来完成的。促凋亡蛋白—Omi/HtrA2位于线粒体膜间隙，在凋亡诱导因子的作用下，Omi/HtrA2被释放到细胞液中，通过caspase途径和非 caspase依赖途径引起细胞凋亡[1，2]。本实验中，我们应用RT-PCR和免疫组化的方法检测经新辅助化疗药物——奈达铂干预的前后口腔颌面头颈鳞癌(鳞癌)组织和鳞癌癌旁组织中Omi/HtrA2表达的情况，判断奈达铂在其中的作用，以期为应用新辅助化疗提高口腔颌面头颈鳞癌控制率及生存率提供新思路。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 选取2012年3月至2013年8月于河北医科大学第四医院口腔科就诊患者45例，术前取病理已确诊为鳞状细胞癌(部分低分化鳞癌进行了免疫组化确诊)，其中高分化者36例，低分化者9例;45例鳞癌患者标本分鳞癌组(术前)、鳞癌组(术后)、鳞癌癌旁(距瘤缘2 cm)组(术前)、鳞癌癌旁组(术后)，以上4组标本均为术后即刻取材，分为两份，一份应用4%甲醛固定，另一份放于-80°低温冰箱编号保存。

    1.2 实验试剂 Omi/HtrA2鼠抗人单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，Maxvision2/HRP免疫组化染色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，Omi/HtrA2及β-actin引物购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，RT-PCR试剂盒及1 500 bp DNAmarker购自美国Promega。

    1.3 方法

    1.3.1 RT-PCR检测mRNA表达变化:将标本组织匀浆后按Triizol试剂盒提供的操作步骤提取总RNA，-80℃保存。应用Promega公司的逆转录试剂盒合成cDNA，操作按试剂盒说明书进行。据GenBank中登录的Omi/HtrA2基因序列，设计引物。上游引物为5’-GACCGGCACCTTTCTTG-3’，下 游 引 物 为 5’-GCCCCCACTGGTTCATTT-3’;β-actin 内参上游引物为5’-CTGTTCCAGCCTTCCTTC-3’，下游引物为 5’-TCCTGCTTGCTAATCCAC-3’。每20微升反应体系包含cDNA 1 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，Nuclease-Free Water 7 μl，Gen Green 10 μl。PCR 步骤:94℃ 预变性5 min，94℃变性 60 s ，52℃ 退火 60 s ......