苏春永 霍华治 杨晓光

    胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，该病恶性度极高，早期侵袭和转移率高，病情进展快，预后严重不良[1]。因此，从肿瘤过度增殖、侵袭和转移的分子机制角度寻找有效的阻断靶点对于胰腺癌的临床治疗具有重要指导意义。环氧合酶-2(COX-2)是花生四烯酸代谢过程中的限速酶之一，在细胞有丝分裂、细胞粘附、疼痛发生发展等病生理过程中发挥重要调控作用。研究表明，胃癌、结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤组织高表达COX-2，参与肿瘤发生、发展、侵袭和转移等多个环节，且与患者预后及存活时间高度相关[2]。最新研究发现，选择性COX-2抑制剂塞来布昔通过抑制恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移发挥明显的抗肿瘤作用[3，4]。然而，塞来布昔是否通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达发挥抗肿瘤作用的报道笔者所见目前尚少。本研究观察胰腺癌组织 COX-2、VEGF、MMP-9的表达状况，并通过体外实验检测VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表达的变化探讨塞来布昔的抗肿瘤机制。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 选取2009年9月至2011年3月我院手术切除的原发性胰腺导管腺癌组织标本50例，均经病理确诊，临床病理资料及随访资料完整。其中男30例，女20例;年龄29～67岁，平均年龄(50±7)岁;病程1～9年，平均(3.2±0.5)年。

    1.2 主要试剂 胰腺癌BXPC-3细胞购自上海中科院细胞库。兔抗人COX-2、VEGF、MMP-9多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。Trizol、Real Time-PCR试剂盒购自美国Promega公司。免疫组化SP试剂盒购自北京中杉金桥技术有限公司。

    1.3 实验方法

    1.3.1 免疫组织化学SP法:采用免疫组化法检测胰腺组织COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表达水平，参照说明书操作。将手术切除的癌组织及癌旁正常组织置于4%多聚甲醛中固定，依次进行脱蜡、水化、高压锅热修复后加入特异性一抗4℃过夜;加入生物素标记的二抗，室温孵育1 h;加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的三抗室温孵育45 min，DAB显色，苏木素染色，封片，光镜观察。结果判定标准:COX-2、VEGF、MMP-9阳性染色的判定以细胞膜(质)中检出棕黄色或深棕色颗粒为标准。随机选取5个有代表性的视野进行观察并计数200个细胞，若阳性细胞数占同类细胞数的比例>5%为阳性，≤5%则为阴性。

    1.3.2 细胞培养:在37℃、5%CO2孵箱中用含10%小牛血清的DMEM培养基常规培养BXPC-3细胞 ......