闫香庭 刘盼 蔺会兰

    在世界范围内，子宫内膜癌在女性肿瘤中排第七位，此病患者数量呈持续性增长，其中包括年轻女性。虽然许多子宫内膜癌表现为雌激素依赖性增殖，但是其致癌机制尚不清楚或尚未完全阐明。多种基因及信号转导通路的改变在恶性肿瘤的发生、发展和转移中发挥了重要的作用，转化生长因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号传导途径便是其中之一。TGF-β调控多种基因的表达，在细胞分化、增殖和凋亡中发挥着重要作用，其受体Ⅰ、Ⅱ(TβRⅠ、Ⅱ)在多种恶性肿瘤组织中表达下降或缺失。导致基因失活的机制主要包括基因突变和表观遗传学修饰，其中表观遗传学修饰中的启动子区高甲基化已被认为是与遗传性缺陷同等重要的分子生物学机制。本研究应用改进的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)，对子宫内膜癌组织中TβRⅠ、Ⅱ两基因启动子甲基化状态进行检测，并对两基因甲基化状态与临床指标之间的关系进行探讨。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 收集2012年8月至2014年3月在我院手术切除的子宫内膜癌组织标本60例和癌旁正常组织60例。所取标本均在液氮中冷冻保存。患者年龄36～69岁，平均年龄51.4岁。所取子宫内膜癌标本经病理确认均为子宫内膜样腺癌。按FIGO(2000年)标准进行手术-病理分期，Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期23例;有淋巴结转移24例，无淋巴结转移36例;高、中分化49例，低分化11例。所有患者术前均未做放化疗。

    1.2 主要试剂 Wizard DNA纯化试剂盒购于Promega公司，亚硫酸氢盐和对苯二酚(氢醌)购于Sigmaaldrich公司，PCR引物购于上海捷瑞生物技术有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 TβRⅠ、TβRⅡ基因甲基化状态的检测:采用酚/氯仿抽提法提取子宫内膜癌组织及癌旁正常组织中的DNA，将提取的DNA进行亚硫酸盐处理，DNA单链中未甲基化的胞嘧啶(C)在亚硫酸盐的作用下脱去氨基转变成尿嘧啶(U)，而发生甲基化的胞嘧啶在甲基的保护下未发生任何改变。然后用Wizard DNA纯化试剂盒对处理过的DNA进行纯化。

    1.3.2 用甲基化特异性引物(M)和非甲基化特异性引物(U)[1，2]对所有标本的纯化 DNA 进行扩增:TβRⅠ的非甲基化引物(5’-3’)为:CAACCCTCCAAAACTAACAACTAAACAA TGTTGGTTTTTGGTTATGTTTTATGTTTTTT，PCR反应体系为95℃预变性12 min，95℃45 s ......