刘宏雷 易力 翟晓莉

    ·论著·

    脑星形细胞瘤中HPA的表达及其对肿瘤细胞侵袭力的影响

    刘宏雷易力翟晓莉

    050011河北省石家庄市第三医院神经外科(刘宏雷),病理科(翟晓莉)；河北医科大学第二医院病理科(易力)

    【摘要】目的观察乙酰肝素酶(HPA)在人脑星形细胞瘤组织的表达及对肿瘤细胞侵袭力的影响。方法采用免疫组化ElivisionTMplus两步法和Real time-PCR法检测75例星形细胞瘤组织和40例正常脑组织中HPA蛋白和mRNA表达情况。通过siRNA干扰技术沉默星形细胞瘤U87细胞中HPA表达，采用Real time PCR、Western blot、Transwell小室实验检测肿瘤细胞HPA、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达及细胞侵袭力变化。结果正常脑组织未见HPA蛋白表达，星形细胞瘤组织中HPA阳性表达率为78.67%(59/75)，星形细胞瘤组织HPA阳性表达率显著高于正常脑组织，且其mRNA表达水平也显著高于正常脑组织，差异有统计学意义(P75%，计算方法为：染色强度×阳性细胞所占百分比；其中：>3分为(+)，6～9分为(++)，10～12分为(+++)，凡(+)或(+)以上者为阳性表达。

    1.2.2细胞培养基转染:在37℃ 5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养U87细胞，将对数生长期的细胞接种于培养皿中，调整细胞密度为1×105个/ml，待细胞融合至30%～50%，将细胞分3组：①空白对照组；②阴性对照组：转染空质粒；③转染组：转染HPA-siRNA。

    1.2.3Real time-PCR:Trizol提取组织或细胞总RNA，按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以β-actin为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2ΔΔCt。见表1。

    表1 Real time PCR引物序列

    1.2.4Western-blot:收集、裂解细胞，提取细胞总蛋白，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清。半干法电泳转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h ......