吴新涛 石晶 高乐才 吴新峰 吴文元 庞石磊

    ·论著·

    柚皮素对氧化应激所致成骨细胞凋亡的影响及机制研究

    吴新涛石晶高乐才吴新峰吴文元庞石磊

    目的观察柚皮素对氧化应激导致的成骨细胞凋亡的影响，并探讨其机制。方法体外分离培养成骨细胞，细胞分空白对照组、单纯H2O2作用组、H2O2+0.1 μmol/L柚皮素组、H2O2+1 μmol/L柚皮素组、H2O2+10 μmol/L柚皮素组。MTT法检测成骨细胞活力；流式细胞术检测成骨细胞凋亡率；荧光显微镜观察活性氧(ROS)含量；比色法检测丙二醛(MDA)含量；Real time-PCR 和Western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达情况。结果与空白对照组比较，单纯H2O2处理组细胞活性明显降低，凋亡率及ROS、MDA含量明显增加；同时Bcl-2 mRNA和蛋白表达明显下调，Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达明显上调(P1 材料与方法

    1.1材料DMEM-H培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；兔抗鼠 Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司；细胞裂解液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；Prime Script TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒购自日本Takara公司；Trizol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司。

    1.2仪器Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统(Biorad公司)；头一回7300 型Real time-PCR扩增仪(美国ABI公司)。

    1.3成骨细胞培养参照相关文献报道体外分离培养成骨细胞[5]。新生24 h大鼠处死后，75%乙醇浸泡10 min，无菌手术揭去头皮，分离颅盖骨，去除表面结缔组织，PBS清洗2～3次后置于无血清DMEM培养基中，组织剪剪碎颅盖骨，加入0.25%胰蛋白酶预消化30 min，加入含血清培养基终止消化。加入0.1% Ⅰ型胶原酶消化45 min，加入预冷PBS 终止消化。过滤后的消化液1 000 r/min 离心10 min，弃上清，培养液冲洗细胞，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，将细胞悬液接种于含10%小牛血清的DMEM-H培养基中培养。待细胞生长至80%融合时根据需要进行相关指标的检测。

    1.4观察指标及方法 ......