周涛 杨丽 刘亮 巨英超

    ·论著·

    应用RNA干扰技术下调ANXA3表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞株的建立

    周涛杨丽刘亮巨英超

    目的建立针对膜联蛋白A3(Annexin A3, ANXA3)的shRNA稳定转染的乳腺癌细胞株MDA-MB-231，为后续进一步研究奠定基础。方法荧光定量RT-PCR及western blot方法检测两种乳腺癌细胞株(MDA-MB-231及MCF-7)中ANXA3 mRNA及蛋白表达水平。构建沉默ANXA3基因的shRNA质粒3个(ANXA3-sh1-3)及阴性对照质粒，脂质体法转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231；选出ANXA3沉默效果最好的干扰质粒做后续实验。嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞；Western blot方法检测转染后细胞中ANXA3蛋白表达水平。结果MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA 及蛋白表达水平显著高于MCF-7中的表达(P1 材料与方法

    1.1材料

    1.1.1细胞株:MDA-MB-231及MCF-7细胞株本实验室传代培养。接种细胞于含10%胎牛血清的PRMI1640培养基中(补充青霉素、链霉素各100 U/L)，培养器皿置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中。

    1.1.2主要试剂及仪器:LipofectamineTM2000(Invintrogen,美国)；PVDF膜、琼脂糖(Bio-Rad,美国)；RPMI-1640培养基、BSA (Sigma,美国)；引物(上海生工，中国)； 高纯度质粒小提中量试剂盒(天根生化科技有限公司,中国)；RNA isolater total RNA extraction reagent、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、qPCR SYBR Green Master mix试剂(Vazyme,中国)；Annexin V-PE/7-AAD试剂盒、MatrigelTM Matrix Basement Membrane(BD公司,美国)；Transwell 3422(Corning公司,美国)；Epics-XL型流式细胞仪(Beckman Coulter公司,美国)；PCR仪(Eppendorf，德国)；Mx3000P荧光定量PCR仪(Agilent,美国)。

    1.2方法

    1.2.1荧光定量RT-PCR检测MDA-MB-231及MCF-7细胞中ANXA3 mRNA表达水平:取生长状态良好处于对数生长期的MDA-MB-231及MCF-7细胞 ......