胡美琴 高琨 唐昃 龚军

    ·论著·

    β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞A549的增殖影响

    胡美琴 高琨 唐昃 龚军

    目的 观察外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法 利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3.1-β-arrestin2质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western blotting检测β-arrestin2基因表达的影响。采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法分析转染细胞的增殖情况。结果 经脂质体转染和筛选,建立了稳定表达β-arrestin2基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较,转染β-arrestin2基因的细胞生长速度明显减慢(P1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞系:人肺腺癌细胞系A549购自中科院上海细胞生物研究所，用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640培养基在37℃,5% CO2的培养箱中培养。

    1.1.2 试剂:质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司,RT-PCR试剂盒、限制性核酸内切酶BamHⅠ,XbaⅠ购自Ferments公司;脂质体购自Invitrogen公司;鼠抗人β-arrestin2抗体购自Santa Cruz Biotechnology;G418,Trizol,DEPC购自上海生物工程技术服务有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 质粒的小量提取及酶切鉴定:将pcDNA3.1-β-arrestin2质粒转化TG1感受态,常规铺板,挑取菌落扩增,采用质粒抽提试剂盒提取质粒,应用限制性内切酶BamHⅠ,XbaⅠ双酶切鉴定质粒。

    1.2.2 质粒转染:以每孔5×105个细胞的密度将A549细胞接种于6孔板中,培养至80%融合时,应用脂质体按说明书进行转染,实验分为3组:未转染组、转染空白质粒(pcDNA3.1)组和转染阳性质粒(pcDNA3.1-β-arrestin2)组。质粒转染48 h后,换含800 μg/L G418的选择培养基培养4 d,再换含300 μg/L G418的选择培养基维持筛选至出现细胞克隆,挑取细胞克隆扩大培养备用。

    1.2.3 定量RT-PCR检测β-arrestin2 mRNA表达的变化:RNA提取按照trizol试剂盒操作指南进行，反转录依照试剂盒操作说明书进行，总反应体系为25 μl，反转录条件为42℃反应60 min，β-arrestin2引物：forward primer:5'-CCCTGGATGGGAAACTCAAG-3';reverse primer: 5'-AGG ATTCCCAGCACCTCCTT-3'；β-actin: forward primer:5'-CCACGAAA CTACCTTCAACT-3';reverse primer: 5'-TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC-3' ......