张伟 谭永胜 马和平

    ·论著·

    miR-31协同5-Fu发挥抗肿瘤作用的体内研究

    张伟 谭永胜 马和平

    目的 探讨miR-31在胃癌细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性方面的影响，以及在小鼠体内miR-31联合5-Fu对胃癌生长的影响和机制。方法 实时定量PCR的方法检测临床耐药胃癌患者癌组织和非胃癌患者胃组织中以及PBMC中的miR-31的表达，野生型MFC细胞和耐5-Fu 的MFC-R细胞中miR-31的表达，同时，流式细胞术检测耐药胃癌患者癌组织和非胃癌患者外周血中Treg细胞的比例，分析miR-31和FOXP3的相关性。MTS检测miR-31对MFC细胞增殖的影响。miR-31和5-Fu联合用药后对小鼠体内肿瘤生长的影响，LDH释放实验检测CD+8T细胞对MFC的杀伤影响。结果 临床耐药胃癌患者癌组织和PBMC中的miR-31水平显著低于非胃癌患者(P1 材料与方法

    1.1 材料与试剂 外周血，人胃癌组织和非胃癌组织来源于内蒙古医院肿瘤科患者以及消化科怀疑胃癌但经组织病理检查确诊的非胃癌患者，胃癌患者对于化疗药物均产生多药物耐药且接受了手术治疗。小鼠胃癌细胞MFC培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。SPF级的615小鼠购买于中国科学院上海生物研究所。PE-anti FOXP3 抗体(克隆号150D)购于Biolegend公司。5-氟脲嘧啶(5-Fu)购于Sigma公司。miR-31mimic， miR-31NC，miR-31 inhibitor 和miR-31 inhibitor NC 由invitrogen公司合成。pGL3-FOXP3-3’UTR(含FOXP3启动子的质粒)由本实验室构建。所有实验均通过了内蒙古人民医院医学伦理委员会同意。

    1.2 5-Fu耐药细胞株的筛选 根据文献报道用逐步增加5-Fu药物浓度的方法筛选耐5-Fu的MFC细胞。具体方法为先用MTS(Promega公司)法检测5-Fu对BGC-823的IC50浓度约为7.49 g/ml。MFC细胞在培养过程中首先加入7.5 g/ml的5-Fu培养24 h，将死亡的细胞用PBS洗去，再加入10 g/ml的5-Fu培养 24 h，反复用浓度逐步增加(10、15、20、25 g/ml)的5-Fu培养4次后，将存活的MFC细胞消化下来并维持在7.5 g/ml的培养基中培养。培养2周后，去掉5-Fu后进行细胞实验，得到的抗5-Fu的MFC细胞命名为MFC-R。

    1.3 质粒的构建 pGL3-FOXP3-3’UTR的构建方法参照Rouas的方法进行构建[19] ......