仇炜 沈永青 张爱莉

    ·论著·

    14-3-3σ基因表达下调促进肾癌细胞增殖

    仇炜 沈永青 张爱莉

    目的 检测14-3-3σ在肾癌(renal cell carcinoma,RCC)及相应正常肾组织(normal tissue,NT)中的mRNA及蛋白表达情况，探讨14-3-3σ在RCC中的作用及其作用机制。方法 随机选择47例经肾肿瘤根治性手术治疗的肾癌患者，提取肾癌组织及正常肾组织mRNA及蛋白，使用RT-PCR法检测肾癌及正常肾组织中14-3-3σ mRNA的表达情况，使用Western blot方法检测14-3-3σ蛋白在肾癌及正常肾组织中的表达水平，统计肾癌组织及正常肾组织中14-3-3σ基因的表达差异。转染肾癌786-O细胞，分别使用质粒过表达或siRNA敲低14-3-3σ基因的表达，使用CCK-8法检测786-O细胞在过表达和敲低14-3-3σ基因后的增殖变化。结果 肾癌组织较正常肾组织14-3-3σ基因mRNA表达水平明显降低(P1 资料与方法

    1.1 一般资料 肾癌患者随机取自于2015年6月至2016年7月在河北医科大学第四医院泌尿外科住院患者47例，其中男34例，女13例；年龄40～82岁，平均年龄 (61.5±8.5) 岁。所有患者经肾肿瘤根治性切除术，术后病理均证实为肾透明细胞癌，所有病例术前均未接受任何化学及放射治疗。取材标准如下：(1)癌组织：患者于术后切取的肿瘤组织标本；(2)正常组织：距离癌组织5 cm以上的肾组织。患者均于术后即刻采集肾癌及正常肾组织，取材后立即保存于液氮中备用。本研究遵循伦理学标准并得到河北医科大学第四医院伦理委员会批准及受试者的知情同意。

    1.2 实验试剂 人肾透明细胞癌786-O细胞系购自国家实验细胞资源共享平台；反转录试剂盒购买自宝生物工程(大连)有限公司，PCR试剂及DEPC水购买自北京康为世纪生物科技有限公司，本研究所使用引物均由上海生工生物工程技术公司提供。14-3-3σ真核细胞过表达载体pcDNA3.1-14-3-3σ质粒及14-3-3σ siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清、PBS、Opti-MEM培养基、胰蛋白酶为美国Gibco公司产品；CCK-8购自日本东仁化学研究所；鼠抗14-3-3σ抗体、鼠抗β-actin抗及羊抗鼠二抗体购自美国Abcam公司。

    1.3 方法

    1.3.1 RNA提取、RT-PCR及PCR扩增:采用Trizol法提取组织总RNA ......