蒋琼

    ·论著·

    LncRNA RSU1P2在宫颈癌肿瘤细胞中作为ceRNA拮抗let-7a促进肿瘤发生的影响研究

    蒋琼

    目的观察lncRNA RSU1P2对宫颈癌肿瘤细胞的影响。方法在Caski、HeLa和C33A细胞中通过转染质粒使RSU1P2过表达，通过MTT试验和集落形成测定法检测RSU1P2对细胞活力的影响，用Transwell测定RSU1P2对细胞的转移和侵袭能力的影响，通过流式细胞仪测定RSU1P2对细胞周期和细胞凋亡的影响通过蛋白(质)印迹法(Western blot)检测EMT相关蛋白的变化，通过动物实验测定RSU1P2在体内对宫颈癌组织的影响等。结果在Hela和C33A等细胞中RSU1P2过表达后，细胞增殖能力、转移侵袭能力和VM均增强(P1 材料与方法

    1.1 临床样本、细胞培养和转染 从14例宫颈癌患者取其宫颈癌组织样本和邻近正常宫颈组织样本，并提取各个样本RNA。人宫颈癌细胞株HeLa和C33A由本实验室既往保存，在RPMI1640培养基(Invitrogen)中培养，该培养基含有10%胎牛血清(FBS)，100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素，置于37℃、CO2体积分数为5%的温箱内培养。使用脂质体2000试剂(Invitrogen)进行细胞转染，根据其说明书进行相关操作。本研究已告知患者及其家属，并签署知情同意书，并在伦理委员会的指导下开展研究。

    1.2 qRT-PCR分析 qRT-PCR分析用于检测RSU1P2的相对转录物水平，let-7a和其靶基因。使用有SYBR 混合液的Taq试剂盒(TaKaRa公司)并根据该试剂盒的说明书进行qRT-PCR扩增及分析。

    1.3 miRNA靶标预测 使用RegRNA，TargetScan和PicTar等最常用的预测方法找到let-7a的下游mRNA靶基因。

    1.4 Western blot分析 收集细胞，加入适量RIPA裂解液裂解细胞收集细胞蛋白液，加入适量的上样缓冲液，并在100℃水浴后进行聚丙烯胺凝胶电泳。PVDF膜转膜后用脱脂奶粉进行封闭，然后用特定的一抗及二抗进行温育，用化学发光法探测三类细胞中IGF1R，N-myc，EphA4，GAPDH的表达。兔抗人GAPDH，NMYC，IGF1R，EphA4的一抗来自Saierbio(天津，中国)，兔抗人BAK来自Santa Cruz Biotechnology公司(加利福尼亚州，美国)。使用LABWORKS 4.0软件所得Western印迹条带进行定量 ......