刘新彦 李建斌 李志强 王丽坤 路继成 李晓丽 刘晓燕

    ·论著·

    DMBT1过表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

    刘新彦 李建斌 李志强 王丽坤 路继成 李晓丽 刘晓燕

    目的观察DMBT1过表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。方法利用脂质体LipofectamineTM 2000转染鼻咽癌5-8F细胞，Real time-PCR、Western-blot验证转染效率。MTT、流式细胞术检测DMBT1过表达对5-8F细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。Western-blot检测DMBT1过表达对多药耐药基因(P-gp)、肿瘤抑制基因p53蛋白表达的影响。MTT法检测DMBT1过表达对化疗药物敏感性的影响。结果转染pcDNA3.1/DMBT1的5-8F细胞中DMBT1表达显著上调(P1 材料与方法

    1.1 试剂 人鼻咽癌5-8F细胞购自中科院典型培养物宝藏委员会细胞库；鼠抗人DMBT1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；Trizol、LipofectamineTM 2000转染试剂盒、RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司；Real time-PCR试剂盒购自美国Promega公司；MTT试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。

    1.2 实验方法

    1.2.1 细胞培养及转染:将人鼻咽癌细胞系5-8F置于含胎牛血清和RPMI1640培养基中，于37℃、5% CO2条件下常规培养。当细胞融合达80%～90%时，胰酶消化细胞，以2×105/孔的密度接种于12孔板，利用脂质体LipofectamineTM 2000转染 5-8F细胞。细胞分3组：未处理组(正常5-8F细胞)、阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1)、转染组(转染pcDNA3.1/DMBT1)。

    1.2.2 Real time-PCR:按照Trizol试剂盒说明书提取对数生长期鼻咽癌5-8F细胞总RNA，在ABI 7300荧光定量PCR仪上进行扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin为内参照基因，2-△△Ct法计算DMBT1基因相对表达水平。见表1。

    表1 引物序列及扩增产物长度

    1.2.3 Western-blot:采用RIPA裂解液提取对数生长期细胞总蛋白 ......