高杨 丛力宁 程毅 刘岩

    黑色素瘤是一种好发于皮肤的高度恶性的肿瘤，有易发生转移，病死率高，预后差[1,2]等特点，且缺乏较有效的治疗手段。斑蝥素是从斑蝥的干燥虫体中提取的一种抗肿瘤活性成分，具有抗肿瘤、升白细胞、增强免疫、抗病毒、抑菌及抗氧化等作用，临床上可用于治疗多种肿瘤。去甲斑蝥素是斑蝥素的衍生物，由人工合成，其毒副作用比斑蝥素低，具有独特的升白细胞作用及较强的抗癌作用。本研究通过去甲斑蝥素作用于人黑色素瘤M14细胞，观察去甲斑蝥素对M14细胞凋亡和有关凋亡基因及细胞内活性氧(ROS)的影响，探讨其可能的抗肿瘤作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂 人M14黑素瘤细胞株，购于中国科学院上海细胞研究所；去甲斑蝥素购于美国Sigma 公司，1640培养基购于美国Gibco公司，CCK8试剂购于日本同仁化学研究所，Trizol试剂购于Invitrogen公司、高效RIPA裂解液购于北京索莱宝来生物技术有限公司，PCR引物购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司，活性氧检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，丙二醛(MDA)检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：M14细胞培养于10%胎牛血清的1640培养基，37℃，5%CO2的恒温培养箱中。于倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态，待细胞融合达到90%以上时，按1∶2或1∶3的比例进行传代。将细胞分为空白对照组和50、100、500 μg/L去甲斑蝥素给药组。

    1.2.2 CCK8检测：细胞活性将对数生长期的M14细胞接种于96 孔板中，每孔5×103个细胞，每组设5个平行孔，待细胞贴壁后，弃去原培养液，实验组每孔加入100 μl的药物，浓度分别为0、50、100、500 μg/L，只加培养基无细胞孔为空白对照组。分别作用12、24 h后，加CCK8每孔10 μl作用2 h，用酶标仪测定每孔450 nm波长的吸光度值并计算抑制率。生长抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%。

    1.2.3 qRT-PCR法检测凋亡相关mRNA的表达

    1.2.3.1 Trizol法提取细胞总RNA：贴壁细胞PBS洗涤3次，加入1 ml Trizol，吹打充分混匀，移至EP管，冰盒静置5 min，加入0.2 ml氯仿，上下剧烈震荡15 s，冰盒静置5 min，2 min，4℃离心，12 000 r/min×15 min，取上层水相移入一新无RNase管中 ......