武凤莲 朱东来 王连英 王嘉欣

    瘢痕是各种创伤引起的正常皮肤组织的病理变化，是人类创面愈合过程中的必然结果[1]，当创面过度修复时，成纤维细胞大量增生以及胶原基质的过度沉积，可发生纤维增生性真皮损伤，并发展成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩[2]。瘢痕疙瘩是结缔组织异常愈合的一种形式，其特征是过度增殖和透明变性[2]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的病因尚不清楚，治疗仍是临床上的一个挑战。目前的治疗方法包括外科和非手术方法，如压迫、硅胶片、冷冻疗法、激光、病灶内注射类固醇、5-Fu和A型肉毒杆菌毒素(BTXA)[3,4]。瘢痕病灶内注射BTXA是目前比较有前途的预防和治疗增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的方法之一。但直到现在其预防及治疗瘢痕的具体机制原理尚不十分清楚[5]。本研究旨在通过A型肉毒毒素对瘢痕中bFGF、caspase-3及 Bcl-2表达的影响，进一步探讨其治疗增生瘢痕的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料与仪器 DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司 USA)；BTXA(兰州生物制品研究所)；Trizol 总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒(美国 PROMEGA公司)，胰蛋白酶购于德国Merk公司；MTT、DMSO、AO/EtBr荧光剂购于SIGMA USA;BCA试剂盒(BD Parmingen 公司)；bFGF抗体、caspase-3抗体及Bcl-2抗体(CTS,英国)；光学显微镜，荧光显微镜，PCR 仪器，凝胶图像分析系统。

    1.2 实验标本 实验所用标本全部来源于2016至2018年秦皇岛市第一医院整形烧伤外科的门诊及住院瘢痕患者。瘢痕部位包括面部、上肢，胸背部，患者近期并没有接受激光、放射线及其他药物治疗，病程最短为3个月，最长为4年。取标本前均得到患者的知情同意。

    1.3 增生性瘢痕成纤维细胞培养 将取下的手术标本按无菌操作程序用配好的抗生素生理盐水进行反复冲洗3次后，剪去多余皮下组织后，将只保留带表皮的瘢痕组织剪成所需大小的小组织块，用PBS缓冲液反复冲洗干净后接种于含有培养液的培养方瓶中，在特定条件的孵箱中进行瘢痕成纤维细胞原代的培养，根据原代成纤维细胞的生长情况进行更换培养瓶中的培养液，一般1周更换2～3次。待原代成纤维细胞爬满瓶底即可进行传代培养，原代细胞从组织块中爬出到铺满培养瓶底一般需要3周左右的时间。本实验所用细胞为3～6代。

    1.4 实验分组 将实验分为5组：对照组(培养液中不加任何干扰因素)，培养液中加入A型肉毒毒素，浓度分别为0.2～1.6 U/ml。 取对数生长期的细胞 ......