华海侠 赵敏 顾涛 付占昭 白立立 刘瑞吉

    研究表明，血清应答因子(serum response factor,SRF)在癌组织中高表达，伴随着E-钙粘蛋白(E-cadherin)、β-catenin(β-连环蛋白)表达的下调，与浸润深度和淋巴结转移关系密切，提示SRF可能是肿瘤侵袭和转移的重要调控机制之一[1]。SRF调控基因表达的主要信号转导通路有两条：一是与增殖有关的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号，另外一条调控通路是Rho信号依赖的肌动蛋白的细胞动力学改变，提示SRF与肿瘤细胞增殖和细胞动力学改变可能有一定的关联[2]。因此本研究拟采用RNA干扰技术，构建多条特异性的针对SRF的siRNA并转染入肺癌A549细胞，采用realtime PCR筛选出干扰效率最高的siRNA-SRF。采用CCK-8法、流式细胞检测、侵袭实验、westernblot等方法，观察SRF表达的下调与细胞增殖和侵袭转移的关系，进一步研究SRF在肺癌细胞增殖、侵袭转移中的分子机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 A549细胞株购自于中科院上海细胞库；siRNA构建及合成购自于上海吉玛制药技术有限公司；细胞培养相关耗材耗材购自于广州洁特生物过滤制品有限公司；CCK-8细胞增殖试剂盒(日本同仁化学研究所)；SRF一抗(sc-335，美国Santa Cruz公司)；Trizol及PCR相关试剂(美国Invitrogen公司)；免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞转染:由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成4条针对SRF基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，各组基因序列详为：①SRF-900：sense：5’-GCCGCGUGAAGAUCAAGAUTT-3’，anti-sense：5’-AUCUUGAUCUU CACGCGGCTT-3’；②SRF-951：sense：5’-CGACCUUCAGCAAGAGGAATT-3’ ......