张敏聪 王晓芳 贾友超 商琰红

    叶酸是人体必需营养物质，其辅酶形式为四氢叶酸，参与一碳基团转移等多种生化反应，从而影响DNA的合成、修复及甲基化。有研究者发现，动物及人类叶酸状态与某些组织癌症发生息息有关，其机制可能与叶酸缺乏诱导了DNA损伤、不稳定、甲基化异常有关[1-3]。本实验将人肺腺癌细胞H1299在无叶酸培养基中培养12 d后，探讨叶酸缺乏与肺腺癌之间的关系。

    1 材料与方法

    1.1 细胞株与试剂 人NSCLC细胞株H1299由中国科学院干细胞库提供；RPMI 1640培养基、无叶酸PRMI 1640培养基、胎牛血清、0.25%胰酶购自Gibco公司；FITC Annexin V凋亡试剂盒购于美国BD公司；台盼蓝染料购于美国Sigma公司；吉姆萨原液、周期检测试剂盒均购自Solarbio公司。

    1.2 细胞培养 将处于对数生长期的H1299细胞分为2组，分别置于含叶酸浓度为0 mg/ml(实验组)、1 mg/ml(对照组)的RPMI-1640培养基中，并将细胞培养于5% CO2、37℃孵箱内，定期换液传代。

    1.3 细胞计数 实验组与对照组均以相同细胞计数(7×105个细胞)传代，且每3天传代1次。传代时将细胞用PBS清洗2次，加胰酶消化至细胞回缩，制备单细胞悬液，台盼蓝染色，相差显微镜下计数活细胞，再以相同细胞计数(7×105个细胞)传代，继续接种培养。

    1.4 细胞形态学观察 分组后，镜下观察不同时期(3 d、6 d、9 d、12 d)2组细胞形态变化。

    1.5 平板克隆形成实验 取实验3 d的2组对数生长期细胞2 000个，接种于6 cm培养皿中，持续培养6 d 后，4%多聚甲醛固定细胞15 min，吉姆萨染色30 min,PBS洗至无背景后室温风干。镜下观察细胞克隆数及形态，计算克隆形成率，克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。 实验重复3次。

    1.6 细胞划痕实验 分别取2组H1299细胞30万个，接种于6孔板中。待细胞愈合率达90%后，用无菌200 μl枪头在6孔板中均匀划线,PBS液清洗6孔板中悬浮的细胞后，加入相应无血清培养基,37℃、5% CO2孵箱继续培养。显微镜下观察不同时间(0 h、24 h、48 h、72 h)划痕面积，并在固定划痕处拍照。 使用Image-Pro plus 6.0软分析划痕面积。划痕愈合率(%)=(0 h 划痕面积-0 h、24 h、48 h及72 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。实验重复3次 ......