马佐鹏 李全成

    中耳胆脂瘤(middle ear cholesteatoma)是中耳角化鳞状上皮的肿瘤性生长，据报道在欧洲每10万人每年7～9人患病[1]，是一种位于中耳的囊形结构，不属于真性肿瘤，但由于其具备肿瘤组织的内部结构，且具有侵袭性、扩张性、非正常调控的增殖和变异性，复发率高，同时大多数患者存在严重的并发症，可导致严重的骨质破坏从而影响正常听力，导致前庭功能障碍、面神经麻痹及颅内外一系列的并发症，甚至引起致命的颅内感染。胆脂瘤发展的基础是中耳腔中的异位角化上皮细胞，但其发病机制尚不完全清楚。各种分子机制，如上皮细胞的分化、增殖[2,3]、上皮细胞凋亡[4]、炎症[5]、感染[6,7]骨质侵蚀、脂质代谢[8,9]和血管生成[10]，都可能在胆脂瘤的发展和行为中发挥作用。中耳胆脂瘤由于鼓室负压，上皮组织增生及袋状内陷，会形成缺氧微环境，缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是细胞及组织在缺氧条件下产生的一种氧依赖的转录激活因子。HIF-1由两个亚基组成，分别为HIF-1α和HIF-1β。其中HIF-1α是决定HIF-1转录活性的关键蛋白[11]。研究发现，HIF-1α与细胞的增殖凋亡密切相关[12]。而缺氧状态下激活的PI3K/AKT信号通路是否通过影响HIF-1α调节胆脂瘤细胞的增殖凋亡从而影响中耳胆脂瘤的发病成为本研究的重点。本研究通过对中耳胆脂瘤组织及原代细胞中HIF-1α及PI3K/AKT信号通路的表达，从分子水平研究缺氧环境对于胆脂瘤形成的关键作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 胆脂瘤组织采集:30例中耳胆脂瘤标本采集于我院耳鼻喉科住院患者，同时随机选取外耳道骨部正常组织10例为对照组，术中新鲜标本放入4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，作4 μm厚的连续切片，为后续HE及免疫组化使用。患者签署知情同意书，并经医院伦理委员会同意。

    1.1.2 原代胆脂瘤细胞(MEC)培养:取5例中耳胆脂瘤组织，置于含有双抗(P/S)的PBS中，反复漂洗后，剪成5 cm×5 mm大小，4℃置于中性蛋白酶12 h，后移入胶原酶Ⅰ常温摇床30 min，用200目筛网过滤后加入教师细胞培养基漂洗，加10%的含血清完全培养基，与37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天换液，细胞融合至80%时进行传代。

    1.1.3 试剂与仪器:胎牛血清(Gibco，美国)，角质细胞培养基(Gibco，美国)、胶原酶Ⅰ(Gibco，美国)、HIF-1α单克隆抗体(Santacruze ......