陆锐均 陈为坚 王晓飞

    椎间盘退变性疾病是一类与年龄增长密切相关的疾病，随着人们生活习惯的改变和老龄化社会的进展，椎间盘退变性疾病的发病率逐年上升，并具有年轻化的趋势，常常引起患者腰腿痛等症状，不仅使患者生活质量显著下降，同时也严重影响患者的生活和劳动能力，对社会和经济的发展造成一定影响[1,2]。因此，临床与科研工作中仍需要进一步探讨椎间盘退变的分子机制，为椎间盘退变性疾病的早期诊治提供新的思路。研究证实，髓核细胞基质代谢异常是椎间盘退变的重要病理特征之一，但其具体的诱发因素仍有争议[3]。DOT1L是人体中重要的甲基化转移酶，可以通过使组蛋白H3第79位赖氨酸发生甲基化，从而参与多种基因的转录调控[4]。近年来的研究显示，DOT1L是重要的软骨保护因子，可以通过调节软骨细胞基质代谢过程而延缓骨性关节炎的发生发展[5]。髓核细胞作为一种类软骨细胞，DOT1L是否也对其发挥保护作用，从而抑制椎间盘退变的发生发展，目前尚未见报道。此外，髓核细胞中DOT1L受到何种转录因子的调控，目前也尚未明确。在本研究中，我们探索了DOT1L在髓核细胞基质代谢中的具体作用，明确了Sp1是调控DOT1L表达的关键转录因子，报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 试剂与仪器 DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清(Gibco，美国)；TNF-α、Ⅱ型胶原酶(R&D，美国)； PBS缓冲液、RIPA蛋白裂解液、蛋白定量试剂盒、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水、SDS-PAGE配胶试剂盒、蛋白Loading Buffer、脱脂奶粉、TBST缓冲液、羊抗兔二抗(碧云天公司，中国)；Trizol提取液、蛋白电泳Marker、PCR引物(Life，美国)；cDNA逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒(TAKARA，日本)；兔抗人DOT1L抗体(77087)、兔抗人Sp1抗体(9389)、兔抗人total-catenin抗体(8480)、兔抗人active-catenin抗体(19807)、兔抗人GAPDH抗体(5174)(CST，美国)；ECL蛋白印迹发光液(Millipore，美国)；敲除/过表达慢病毒(吉玛基因，中国)；离心管(15 ml、50 ml)、6孔板、96孔板、EP管、25 cm2培养瓶(Corning，美国)，移液器(Eppendorf，德国)。生物安全柜、CO2恒温培养箱、酶标仪、低温高速离心机、Nano分光光度计、PCR仪、凝胶成像仪(Thermo Fisher，美国)；Roche480荧光定量PCR仪(Roche ......