樊萍 冯秀媛 胡楠 蒲丹 吕晓虹 孙怡宁 何岚

    骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者临床表现主要为关节僵硬、疼痛、肿胀等，性别、年龄及炎性反应等多种因素均与OA发生发展密切相关[1]。OA病理特征主要为关节软骨退变、软骨细胞外基质减少，软骨细胞是软骨组织中主要细胞类型，且具有维持软骨完整性功能，并可有效维持软骨损伤及重构的平衡关系[2,3]。研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可通过调控软骨组织降解及软骨细胞凋亡而参与OA发生及发展过程[4,5]。但部分miRNA在OA发生发展过程中的作用机制尚未完全阐明。通过寻找新型miRNA探究其在OA致病机制中的作用有助于寻找治疗该病的新方法。研究表明微小RNA-138(microRNA-138，miR-138)通过抑制WNT/β-Catenin信号通路而促进NEK2诱导的软骨细胞存活[6]。但关于miR-138如何通过调控下游靶基因而发挥作用尚未可知。靶基因预测显示G蛋白偶联受体激酶 6(G protein-coupled receptor kinase 6，GRK6)可能是miR-138的靶基因，有研究指出抑制GRK6表达可减弱IL-1β诱导的软骨细胞外基质降解，减轻软骨细胞炎症损伤[7]。但OA软骨细胞中GRK6的表达水平是否受miR-138表达的影响尚未可知。因此，本研究通过探讨miR-138与GRK6的靶向调控作用，分析其对OA软骨细胞增殖及凋亡的影响及潜在作用机制，以期为OA治疗奠定理论基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料 庆大霉素、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购自上海生工生物工程有限公司；Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司；Lipofectamine2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；miR-138 mimics与无意义小分子阴性对照片段(miR-con)、GRK6小干扰RNA(si-GRK6)及阴性对照(si-con)均购自美国Invitrogen公司；青霉素与链霉素均购自美国Sigma公司；兔抗人GRK6、Bcl-2、Bax抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗均购自美国Abcam公司；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司；miR-138、U6、GRK6、β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 ......