徐真谛 李润芝 李元宽 杨小生

    1 材料与方法

    1.2 细胞株 人非小细胞肺癌细胞系A549购自中国科学院。

    1.3 方法

    1.3.1 细胞培养:A549细胞用含10%胎牛血清的RPIM 1640培养基置于37℃、5%的CO2孵箱中进行培养。

    1.3.2 细胞刺激:A549细胞以5×105个/孔铺于24孔板中，加入10 ng/ml的细胞因子IFN-γ、IL-17A、TNF-α或GM-CSF进行刺激24 h，或加入10 μmol/L的BAY 11-7082(NF-κB抑制剂组)、STAT5-IN-1(STAT5抑制剂组)、AS1517499(STAT6抑制剂组)、Fludarabine(STAT1抑制剂组)、FLLL32(STAT3抑制剂组)或DMSO(与抑制剂中的DMSO含量相当，DMSO组)以及培养基(对照组)预先孵育1 h，然后清洗掉孔中的培养基，再加入新的RPMI 1640培养基，同时利用10 ng/ml 的IFN-γ进行刺激24 h，收集A549细胞，用于PD-L1的水平检测。

    1.3.3 流式细胞术:胰酶消化培养的A549细胞，利用无菌PBS清洗2次，然后加入PE标记的抗人PD-L1抗体及相应的同型IgG抗体，于4℃孵育30 min，随后用PBS清洗2次，加入4%的多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗2次后重悬细胞，利用流式细胞仪检测A549细胞表达PD-L1的情况。

    1.3.4 外周血单个核细胞的分离:取体检健康人的外周血，用无菌PBS按照1∶1的体积比进行稀释 ......