江静 陈勇 蒋璐

    宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，也是影响全球女性癌症死亡的主要原因之一[1]。目前宫颈癌的主要治疗方法包括手术(包括盆腔淋巴结切除术和根治性子宫切除术)、放疗和化疗。虽然这些治疗方法取得了一定的进展，但宫颈癌患者的生存率并未得到显著提高。放疗和化疗产生较大的不良反应，严重阻碍治疗效果，且在很大程度上影响患者的生活质量[2]。目前，包括分子靶向治疗和基因治疗等治疗方式替代辅助治疗，在肿瘤治疗中得到广泛应用[3,4]。宫颈癌的发生和发展与癌基因的激活、抑癌基因的失活等多基因调控密切相关[5]。因此，发掘与宫颈癌发生相关的基因，并探索其作用机制对宫颈癌的基因治疗和患者预后具有重要意义。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)基因位于染色体9p21上，属于肿瘤抑制基因。有报道在几种类型的恶性肿瘤中CDKN2A基因启动子区域的高甲基化导致其失活，包括食管癌、乳腺癌和鳞状细胞肺癌等[6-8]。系统鉴定浸润性宫颈癌发展中的关键基因和途径中发现，CDKN2A等基因的调节异常可能与宫颈癌的进展相关[9]。但CDKN2A在宫颈癌组织的表达情况及对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响笔者尚未见报道。因此，本研究检测CDKN2A在宫颈癌组织的表达情况，并通过体外实验研究CDKN2A对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响，并进一步探究其可能的分子机制，以期为宫颈癌的基因治疗提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料 收集2018年6月至2019年6月在重庆市第七人民医院和陆军军医大学第一附属医院行手术切除的宫颈癌组织及相应癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)标本，共30例，标本取下立即置于液氮中保存，患者年龄35～65岁。标本均经病理科鉴定，标本采集均经患者及家属知情同意并签署知情同意书，且经过医院的伦理学通过；患者术前均未接受放疗或化疗等其他辅助治疗。

    1.2 细胞株与主要试剂 人宫颈癌SiHa细胞株(中国科学院上海细胞库)；胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；青霉素-链霉素双抗(北京雷根生物技术有限公司)；CDKN2A过表达载体质粒(pc-CDKN2A)及空载质粒(pcDNA)(广州锐博生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(美国Invitrogen公司)；MTT试剂(美国Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI双染色细凋亡检测试剂盒(日本TaKaRa公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒(美国Piece公司)；PCNA、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin和c-myc单抗及二抗(美国CST公司) ......