熊志伟 刘少波 谢志敏 谷万春 李燕

    脑胶质瘤是一种临床较为常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，主要由机体脑组织胶质细胞癌变发生的，主要临床表现为头痛、视力下降、呕吐、精神症状等，对患者身体健康、生活质量造成严重的影响[1-3]。近年来，我国脑胶质瘤症状发病率一直居高不下，引起广大专家学者的关注，相比其他恶性肿瘤，脑胶质瘤具有恶性程度高、治疗难度大、治疗后复发率高、病死率高等特点，因此大多数专家学者开始致力于脑胶质瘤发病机制、临床治疗的研究[4,5]。本文研究中设计实验，靶向调控脑胶质瘤miR-720表达，并对Wnt通路蛋白表达情况进行检测，旨在探究miR-720靶向调控Wnt通路对脑胶质瘤细胞生物学行为的影响。

    1 材料与方法

    1.1 材料 研究细胞：脑胶质瘤细胞(中国医学科学院)。主要试剂：兔抗大鼠miR-720抗体(Sigma公司)；兔抗小鼠P53抗体(Hyclone公司)；兔抗小鼠caspase3抗体(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2抗体(BD公司)；小鼠抗大鼠Bax抗体(Gibco公司)；小鼠抗兔Wnt3a、β-catenin抗体(Selleck公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养:在40℃的环境中对冻存的脑胶质瘤细胞进行火浴处理，之后进行充分摇晃，将摇晃均匀的脑胶质瘤细胞置于2 ml的培养基[10%PBS、1%双抗(青链霉素)RPMI-1640培养基500 ml]之内，之后使用2 000 r/min的离心机进行离心处理，进行重悬处理后将细胞传代，使用CO2培养箱对培养基培养24 h、换液，细胞融合率达90%后传代。

    1.2.2 慢病毒载体构建及分组:miR-720基因序列根据质粒特点进行引物设计，引入SacⅠ酶切位点，miR-720正向引物序列：5’UCUCGCUGGGGCCUCCA3’。miR-720反向引物序列：5’GAGGCCCCAGCGAGAUU3’。正反链混合后加入退火缓冲液，96℃反应4 min，室温冷却，生成双链。使用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1 ......