罗荣荣 吴震 邵伯云

    慢性阻塞性肺疾病是常见的呼吸系统疾病，其与香烟烟雾有关，香烟烟雾中含有很多种有害物质，可以促进支气管上皮细胞损伤[1]。支气管上皮细胞有十分广泛的生理功能，也是保护气道组织的第一道屏障，支气管上皮细胞在损伤修复、生物代谢、抗原递呈、氧化应激等过程中发挥作用[2]。支气管上皮细胞是慢性阻塞性肺疾病的重要靶细胞之一，其损伤发生与细胞内多个基因的表达有关[3]。miRNA是一类没有编码功能的小分子RNA，其有很多生物学作用，对细胞分化、凋亡、代谢、氧化平衡等均有调控功能[4]。研究表明，miRNA参与慢性阻塞性肺疾病发生，与支气管上皮细胞损伤有关[5]。既往研究证实，miR-3177-3p在慢性阻塞性肺疾病中表达下调，并且随着疾病严重程度的增加，miR-3177-3p表达水平越低[6]。TLR4是一个多功能调控因子，在细胞凋亡、氧化应激等过程中发挥作用[7]。目前已知TLR4在CSE诱导的支气管上皮细胞损伤中过度激活，并且下调TLR4抑制支气管上皮细胞凋亡[8]。本实验研究miR-3177-3p通过TLR4对CSE诱导的支气管上皮细胞凋亡的影响，为靶向基因改善慢性阻塞性肺疾病提供思路。

    1 材料与方法

    1.1 材料 支气管上皮细胞16HBE购自上海美轩生物科技有限公司；mimics control、miR-3177-3p mimics、pcDNA-TLR4、pcDNA均由北京吉田生物科技有限公司合成构建；Bax抗体、Bcl-2抗体购自美国Abgent；TLR4抗体购自齐一生物科技(上海)有限公司；GSH-Px检测试剂盒购自上海超研生物科技有限公司；MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；SOD检测试剂盒购自北京博迈斯科技发展有限公司。

    1.2 CSE的制备方法[9]将已经去掉过滤嘴后的2支香烟于超净工作台中点燃，燃烧10 min，抽取的烟雾溶解在体积为50 μl的DMEM/F12中，充分摇匀，然后添加NaOH将pH值调整为7.4，经过0.22 μm的微孔过滤以后，即为浓度为100%的CSE溶液，在实验时需要用DMEM/F12将CSE稀释为10%。

    1.3 实验分组 支气管上皮细胞在含有100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素、10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养，条件：37℃，饱和湿度，5% CO2、95%空气。支气管上皮细胞分成Control组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组，CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-3177-3p组细胞在实验0 h时 ......