梁青松 贾军 胡欣

    肺癌临床治疗效果不佳，易复发和转移[1]。肺癌细胞迁移和侵袭是肺癌复发和转移的主要原因[2]，探讨影响其迁移和侵袭的分子机制对预后改善具有重要意义。miR-519a是一种微小RNA(miRNA)，有报道称其在非小细胞肺癌组织中表达降低[3]，然而，其对肺癌细胞恶性表型的影响及机制还未知。Starbase生物信息学软件预测显示，多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移酶4(GALNT4)可能是miR-519a-3p的靶基因。GALNT4是N-乙酰氨基半乳糖转移酶的多肽家族成员，是催化O-聚糖合成的关键酶。研究显示，GALNT4在前列腺癌[4]、结肠癌[5]等肿瘤细胞中表达升高，促进肿瘤细胞的恶性表达，发挥促癌基因作用。本研究以miR-519a-3p/GALNT4轴为切入点，探讨影响肺癌发生发展的分子机制，以期为肺癌治疗提供新靶点。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料 正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975，中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)，美国Hycolne公司；RPMI 1640培养基、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒及双荧光素酶活性检测试剂盒，北京索莱宝；LipofectamineTM 2000试剂盒，美国Invitrogen公司；RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物；GALNT4抗体，上海钰博生物科技有限公司；兔抗人基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；兔抗人磷脂酞肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化AKT(p-AKT)单克隆抗体，北京中杉金桥生物试剂公司；PCR引物、miR-519a-3p mimcs、miR-NC、si-GALNT4、si-NC、anti-miR-519a-3p及anti-miR-NC、pcDNA-GALNT4及pcDNA，上海吉玛制药技术有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养:复苏正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975，均用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。细胞融合至80%左右时，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例传代培养。将对数期BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975细胞均接种于6孔板中(1.0×105个/孔) ......