韩朝辉 龙静 刘洁玲 陈学 王静

    宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，在全球女性常见恶性肿瘤中发病率排名第四，大多数患者进行治疗时，已进入疾病中晚期，因而治愈困难，易复发，对女性的生命健康造成严重威胁[1,2]。化疗是宫颈癌的主要临床治疗手段，顺铂(cisplatin，DDP)作为化疗一线药物，广泛应用于宫颈癌，特别是晚期宫颈癌的治疗，但长期应用顺铂易使肿瘤细胞产生耐药性，严重影响疗效，导致治疗失败[3,4]。miR-199b-5p是一种肿瘤抑制因子，可介导调控癌细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移和化疗耐药过程，上调其表达，可减轻大肠癌的远处迁移，抑制三阴乳腺癌的裸鼠异种移植瘤生长，降低其增殖和侵袭迁移能力，并减弱其顺铂耐药性[5,6]；另外有研究发现，miR-199b-5p在宫颈癌组织中表达水平比较正常宫颈组织明显降低，促进其表达，可降低人乳头瘤病毒引发宫颈癌的危险性[7]，因而推测miR-199b-5p可能参与调控宫颈癌细胞的顺铂耐药过程。透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1，HAPLN1)可调控肿瘤的耐药性，是多发性骨髓瘤的一种致病因子，上调其表达，可促使多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米产生耐药性；敲低HAPLN1的表达，可增强人大肠癌耐药细胞株对甲氨蝶呤的敏感性，增强甲氨蝶呤导致的大肠癌细胞凋亡[8,9]，HAPLN1在肾透明细胞癌中高表达，且受miR-199a-5p调控，并与患者的总体生存率显著负相关[10]，但miR-199b-5p对宫颈癌细胞顺铂耐药性和HAPLN1表达的调控作用，目前还未有研究，本文通过构建人宫颈癌顺铂耐药细胞株HeLa/DDP，对此进行初步探讨。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞与试剂：人宫颈癌细胞HeLa、MEM培养基、青链霉素溶液购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0101、PM150410、PB180120；顺铂(纯度≥98%)购买于上海信裕生物科技有限公司，货号XY24462；胎牛血清、Opti-MEM培养基购买于美国Gibco公司，货号10099-141、31985-070；LipofectamineTM2000、CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、总RNA提取试剂盒、一步法逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMII、高效RIPA裂解液购买于北京索莱宝科技有限公司，货号11668-027、CA1210、PC0020、CA1050、R1200、T2240、SR1110、R0010；miR-199b-5p、U6、GAPDH、HAPLN1及多药耐药基因1(multidrug resistance 1 ......