雷伟 李爽 陈海涛 王军

    急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是脓毒症引起的多器官衰竭的主要并发症之一，并伴有高死亡率[1]。肾小管上皮细胞凋亡是脓毒性AKI的重要病理机制[2,3]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是一种来自革兰氏阴性菌的内毒素，是与脓毒症相关AKI发展的主要因素[4]。LPS诱导的AKI模型已被普遍认为可用以研究肾组织损伤和肾小管细胞凋亡的病理生理学[5,6]。因此，研究LPS诱导肾小管上皮细胞损伤的分子机制，对开发新的修复肾小管上皮细胞的药物具有重要意义。研究发现，Klotho基因在肾小管具有广泛的生物学作用，包括调节肾脏钙磷代谢平衡、抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等；参与多种肾脏疾病的发生发展，可作为AKI的潜在生物标志物和治疗靶点[7]。MicroRNA-199b-5p(miR-199b-5p)是一种小的非编码RNA，可靶向Klotho的3’UTR，早前已发现miR-199b-5p在多种癌症中高表达[8]；糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者血清miR-199b-5p水平升高，而Klotho蛋白水平降低，下调miR-199b-5p可上调Klotho，减轻DN肾小管损伤[9]。研究显示脓毒症患者血细胞miR-199b-5p水平升高，可作为脓毒症和脓毒性休克的潜在早期指标[10]。本研究通过LPS诱导建立了大鼠肾小管上皮细胞损伤模型，分析miR-199b-5p和Klotho的表达变化，并进一步阐明其在肾小管上皮细胞损伤中的作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料 NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CP-R062)；LPS、Lipofectamine 3000转染试剂(Sigma-Aldrich，货号：L5293、L3037)；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gbico公司)；miR-199b-5p inhibitor及其阴性对照(inhibitor-NC)由上海GenePharma合成；sh-Klotho及其阴性对照质粒(sh-NC)购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；大鼠白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(ml002859)ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，货号：ml102828、ml002859)；超氧化物歧化酶(SOD)(WST-1法)、丙二醛(MDA)(TBA法)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)(比色法)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所 ......