李蓉 姚国敏 周凌霄 闫瑾 张敏 李亚

    在对先天性静脉畸形骨肥大综合征患者的研究中，发现了具有多个特殊结构域的新基因，即G补缀FHA域血管生成因子1(angiogenic factor with G patch and FHA domains 1，AGGF1)。该基因广泛表达于人体组织和器官，如脑、眼、心脏等[1]。血管生成是指血管内皮细胞在已形成的毛细血管的基础上原位增殖和迁移，以形成新毛细血管的过程[2]。血管生成涉及多种因素和复杂信号[3]，其中，近年来AGGF1已被证实参与血管发育，具有强烈的促血管生成作用[4]。在血管性疾病领域，AGGF1具有治疗冠心病及心肌梗死[5]、糖尿病血管并发症的潜能[6]。而在肿瘤领域，AGGF1被证实是抗肿瘤血管新生、抑制肿瘤转移的重要靶点[7,8]。研究证实，AGGF1促进了高糖、高氧下的视网膜新生血管形成，可能参与了糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜疾病的病理机制[9,10]。自噬是一种作为对应激的应答、被严格调控的溶酶体降解机制，从而维持细胞内稳态，在生理状态和疾病中均发挥重要作用[11]。我们的前期研究表明，应激状态下视网膜血管内皮细胞自噬的激活参与了视网膜血管生成过程[12,13]。鉴于此，我们推测，激活细胞自噬可能是AGGF1发挥促视网膜血管生成的一种重要机制。本研究拟以视网膜血管内皮细胞为对象，观察AGGF1作用下对细胞迁移和管腔结构形成的影响，进而通过阻断自噬激活的关键信号通路，观察AGGF1对视网膜血管生成的作用是否受到抑制，从而明确AGGF1发挥促视网膜新生血管生成作用的自噬机制，为进一步研究AGGF1在眼部疾病中的治疗潜能和作用靶点奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂与仪器 人视网膜血管内皮细胞(HRMECs，上海中乔新舟生物科技有限公司)；M199培养基、胎牛血清及0.25%胰酶(美国Gibco公司)；人AGGF1重组蛋白(美国Abnova公司)；AMPK 抑制剂Compound C(美国Selleck公司)；Transwell小室及Matrigel(美国BD公司)；细胞RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；兔抗人一抗AMPK、p-AMPK，mTOR，p-mTOR，ULK1，p-ULK1(美国Cell signaling公司)；兔多抗GAPDH (杭州贤至生物有限公司)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；GFP-LC3B质粒(北京义翘神州生物技术有限公司)；Lip2000转染试剂及Opti-MEM培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)；CO2恒温培养箱(日本SANYO ......