程涛 赵沱 杨洁

    急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的病情发展迅速,死亡率高[1]。临床上首选经皮冠状动脉介入法治疗,常伴随心肌缺血再灌注损伤[2]。缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是人体许多疾病的一种重要病理过程,尤其是心肌梗死[3]。长非编码RNA(LncRNAs)为长度>200个核苷酸的非编码转录本,其与各种生物过程密切相关,如细胞生长、分化、增殖和凋亡[4]。研究表明LncRNAs可以调节多种心血管疾病的病理生理过程,包括心肌梗死、心力衰竭[5]。LncRNA KCNQ1重叠转录本1(KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)在糖尿病心肌病、心肌梗死、缺血再灌注心肌损伤中表达均异常上调,不利于细胞的存活[6,7]。本研究探讨KCNQ1OT1调控缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)心肌细胞增殖、凋亡的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 H9c2细胞购自中国(上海)科学研究院细胞库;EMDM培养液购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青;LipofectamineTM3000试剂购自中国赛默飞世尔科技;细胞计数试剂盒(CCK8)购自日本同仁;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛生物;RⅡPA裂解液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物;兔抗P65单克隆抗体、兔抗PHB多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体及HRP标记的山羊抗兔二抗购自上海艾博抗体;ECL超敏化学发光试剂盒购自北京普利莱基因生物;RNA提取液Trizol购自美国Invitrogen公司;实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒购自北京天根生物;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翌圣生物;所有引物的设计合成及antagomiRNA、antagomiR-10a-5p、agomiRNA、agomiR-10a-5p的设计合成均委托上海吉玛完成。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：H9c2细胞用含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养液培养,在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养,隔天更换1次培养液。

    1.2.2 转染与分组：正常培养的H9c2细胞设为H9c2组;将H9c2细胞常规培养12 h,更换至5%CO2、95%N2的培养箱中缺氧培养4 h,再复氧常规气体培养6 h,设为H/R H9c2组;使用LipofectamineTM3000试剂将pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-KCNQ1OT1组(转染pcDNA-KCNQ1OT1)、antagomiRNA组(转染antagomiRNA)、antagomiR-10a-5p组(转染antagomiR-10a-5p)、pcDNA-KCNQ1OT1+agomiRNA组(共转染pcDNA-KCNQ1OT1和agomiRNA)、pcDNA-KCNQ1OT1+agomiR-10a-5p组(共转染pcDNA-KCNQ1OT1和agomiR-10a-5p)按照1∶5加入转染试剂转染12 h,进行缺氧复氧培养 ......