田国永 李玲 吕志军

    口腔癌是口腔颌面部最高发的恶性肿瘤,其中口腔鳞状细胞癌占90%以上,是口腔癌最主要的组织病理类型[1]。目前,虽然口腔鳞癌的治疗技术取得了进步,但由于诊断的推迟,生存率并不十分理想[2,3]。肿瘤的转移和复发是口腔鳞癌最致命的,研究表明,多数发生转移的患者生存不超过1年[4]。因此,了解口腔鳞癌相关分子机制对开发特异性诊断方法和个体化治疗策略至关重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种小分子单链非编码RNA,可通过与靶mRNA的3’UTR结合,对靶mRNA进行负向调控,诱导其降解并干扰翻译过程,在生物过程中发挥转录后调控作用[5,6]。越来越多的证据表明,miRNA表达失调可作为抑癌因子或促癌因子,参与肿瘤的发生,如miR-204-3p、miR-19a-3p、miR-145-5p、miR-200a-3p、miR-152等[7-11]。miR-150-5p被报道在口腔鳞癌中表达失调,具有抑癌作用[12]。但其调控口腔鳞癌细胞恶性进展的作用及机制还有待进一步研究。

    1 材料与方法

    1.1 组织样本收集 收集在我院进行手术治疗的170例口腔鳞癌患者的癌组织和癌旁正常组织样本。术中切除组织样本,用流水冲洗后,立即放入液氮,然后置于超低温冰箱中保存。所有患者术前均为进行放化疗、免疫治疗等辅助治疗,并同意样本采集。本研究经医院伦理委员会批准。

    1.2 细胞培养及转染 (1)人口腔上皮胶质细胞系HOK和口腔鳞癌细胞株HN6、SCC-25和CAL-27均购自中国科学院上海细胞库。在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素混合液的DEME培养基中,置于含5%CO2的37℃培养箱中培养。(2)miR-150-5p 模拟物/抑制物(mimics/inhibitors,分别记为miR-150-5p和anti-miR-150-5p)及它们的阴性对照(分别记为miR-con和anti-miR-con)、靶向IGF2BP2的siRNA序列(记为si-IGF2BP2)及其无意义siRNA(si-con),均由广州锐博生物有限公司合成提供。分别使用Lipofectamine 3000试剂转染CAL-27细胞。

    1.3 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR) 组织或细胞总RNA使用Trizol试剂提取,之后使用逆转录酶进行逆转录反应,合成cDNA。然后,以cDNA为模板,使用ABI SYBR Green荧光定量试剂盒进行qRT-PCR反应。实验中使用引物序列如下:miR-150-5p正向5’-GTATGATCTCCCAACCCTTGTACCAG-3’,反向5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;IGF2BP2正向5’-GGAACAAGTCAACACAGACACA-3’,反向5’-AACTGATGCCCGCTTAGCTT-3’;U6正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA -3’,反向5’- CGAATTTGCGTGTCATCCT-3’;GAPDH正向5’- AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3’,反向5’- GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGG -3’ ......