岳杨 郑露 雍丹 许海

    鼻咽癌(NPC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,它具有非常独特的分布模式,在东南亚更为普遍[1]。NPC患者的常规治疗方法是化疗和放疗。虽然治疗显示出良好的疗效,但高复发率和转移率成为治疗失败的主要原因,且预后较差[2]。因此,制定有效的治疗策略和寻找新的预后分子标志物对于提高NPC患者的生存率是必要的。研究表明,CircRNA可作为癌基因或肿瘤抑制基因,因此,CircRNA的失调被确定参与癌症发展的过程[3,4]。研究发现,敲低CircTRAF3可抑制NPC的发生,是NPC治疗的潜在治疗靶点[5]。已有文献表明CircRNA-miRNA-mRNA信号轴参与NPC的发展过程[6]。本研究通过TargetScan网站以及双荧光素酶报告基因实验发现CircTRAF3与miR-136-5p,miR-136-5p与NMT1存在结合位点,且有研究发现,下调miR-136-5p可以促进NPC细胞的恶性增殖[7]。而上调NMT1可以促进NPC细胞的迁移、侵袭、上皮间质转化(EMT)进展[8]。本研究探究CircTRAF3对NPC细胞恶性生物学行为的影响以及其作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 细胞与主要材料 BALB/c小鼠体重(20±2)g[许可证号:SCXK(粤)2021-0059]购自广州锐格生物科技有限公司;人鼻咽癌细胞系5-8F、HONE-1、CNE-2、HNE-1、鼻咽上皮细胞系NP69购自上海烜雅生物科技有限公司;MTT细胞增殖检测试剂盒购自浙江麦飞生物科技有限公司;si-NC、si-CircTRAF3、inhibitor NC、miR-136-5p inhibitor购自上海生工;NMT1和GAPDH抗体购自Abcam。

    1.2 细胞培养与分组 将购买的5-8F、HONE-1、CNE-2、HNE-1细胞和NP69细胞均接种于RPMI-1640培养基(补充有10%胎牛血清)在37℃、5%CO2下培养。待细胞生长至80%左右,根据转染试剂盒将si-NC、si-CircTRAF3、si-CircTRAF3+inhibitor NC、si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor分别转染至HONE-1细胞,记为si-NC组、si-CircTRAF3组、si-CircTRAF3+inhibitor NC组、si-CircTRAF3+miR-136-5p inhibitor 组,另取未做任何处理的HONE-1细胞记为NC组。转染48 h后,用于后续实验。

    1.3 双荧光素酶报告基因实验检测CircTRAF3、miR-136-5p、NMT1关系 构建TRAF3野生型质粒(TRAF3-WT)和突变型质粒(TRAF3-MUT),将TRAF3-WT和TRAF3-MUT分别与mimic NC或miR-136-5p mimic共转染于HONE-1细胞分别记为miR-NC+WT-TRAF3组、miR-136-5p mimic+WT-TRAF3组、miR-NC+MUT-TRAF3组、miR-136-5p mimic+MUT-TRAF3组;构建NMT1野生型质粒(NMT1-WT)和突变型质粒(NMT1-MUT),将NMT1-WT和NMT1-MUT分别与mimic NC或miR-136-5p mimic共转染于HONE-1细胞,分别记为miR-NC+WT-NMT1组、miR-136-5p mimic+WT-NMT1组、miR-NC+MUT-NMT1组、miR-136-5p mimic+MUT-NMT1组,48 h后评估HONE-1细胞的荧光素酶活性变化 ......