陈思宇 强立娟 朱嘉兴 马世兰 陈占龙

    脓毒血症是指由感染引起的全身炎性反应综合征,其发病率很高,可由任何部位的感染引起,能够导致机体多个器官功能障碍,引起患者死亡[1]。脓毒血症急性肾损伤(sepsis associated acute kidney injury,SA-AKI)是脓毒血症最常见的并发症之一,SA-AKI以肾脏排泄功能迅速丧失为主要特征,可严重影响脓毒血症患者预后并增加患者病死率[2]。目前,笔者发现临床上尚缺乏有效预防和治疗SA-AKI的干预措施,因此,探索SA-AKI具体致病机制,明确SA-AKI的重要调节因子,对提高脓毒血症治疗效果、防治SA-AKI具有重要意义。肾小管上皮细胞损伤是SA-AKI的典型病理特征,研究发现,脓毒血症病理生理情况下,缺氧是引起肾小管上皮损伤的重要致病因素[3]。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)是机体适应缺氧环境机制中的最主要因素,也是脓毒血症引起多器官功能损伤的主要原因之一[4]。在缺氧性肾损伤中,HIF-1α主要表达于肾小管上皮细胞,HIF-1α调控的下游通路在调节能量代谢、线粒体功能、细胞凋亡等多种生理病理过程中发挥重要作用[5]。在SA-AKI的进程中,HIF-1α可以通过调节能量代谢、促进血管再生、降低细胞耗氧来调节肾损伤[6]。但目前笔者发现其在SA-AKI中的详细机制尚未阐明。MicroRNA(miRNA)是一种内源性非编码小RNA,通过调节靶基因表达参与氧化应激、炎性反应、细胞凋亡等过程。近年来一些研究提示miRNA在调节肾脏损伤和修复等方面发挥至关重要的作用[7-8]。研究表明,miR-23a可通过多种途径调节脓毒血症损伤期间的炎性反应和细胞凋亡[9-10]。作为一种调节氧稳态的核转录因子,HIF-1α已被证实可以直接调控多种miRNA的表达[11]。然而,SA-AKI病理生理过程中HIF-1α和miR-23a的作用机制及相互关系尚不完全清楚。因此,本研究体外培养肾小管上皮细胞,探讨肾小管上皮细胞中HIF-1α表达对miR-23a的调控作用,并分析二者参与SA-AKI发生、发展的作用机制,以期为临床防治SA-AKI提供新的实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 实验细胞:人近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)购自中国上海科学院细胞库。

    1.1.2 主要试剂:DMEM/F12培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(规格:10 mg)购自上海吉至生化科技公司;HIF-1α小干扰RNA序列(HIF-1α siRNA)及其阴性对照序列(NC siRNA)、miR-23a模拟物(miR-23a mimic)及其阴性对照(miR-NC)、miR-23a抑制剂(anti-miR-23a)及其阴性对照(anti-miR-NC)均购自上海吉玛公司;Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司;TRIzol试剂、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司;CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒均购自上海爱必信生物科技公司;白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA检测试剂盒购自北京鼎国昌盛公司;HIF-1α、核转录因子-κB-p65(nuclear factorκB-p65,NF-κB-p65)、磷酸化NF-κB-p65(p-NF-κB-p65)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)、GAPDH一抗、过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗均购自英国abcam公司 ......