唐悦玲 李心怡

    瘢痕疙瘩是皮肤伤口愈合异常形成的瘢痕组织,病变超出损伤部位范围,持续生长且无自愈倾向[1]。瘢痕疙瘩不仅引起疼痛和瘙痒等不适反应,而且影响正常身体功能,同时也影响美观,给患者的生活质量和身心健康带来极大的损害[2]。大量细胞参与瘢痕疙瘩的形成过程,其中成纤维细胞处于核心位置[3]。成纤维细胞功能异常活化,导致细胞异常增殖和胶原过度合成,从而导致瘢痕不断生长和扩大,形成瘢痕疙瘩,具有类似肿瘤细胞的特征,因此瘢痕疙瘩又被成为皮肤良性肿瘤[3]。目前,瘢痕疙瘩的临床治疗手段多种多样,但是治疗效果却不令人满意,并且治疗后复发率极高[4]。近年来,中药治疗瘢痕疙瘩取得了一定的进展,受到了广泛的关注和研究[5]。特别是鉴定中草药中对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成具有调控作用的活性单体成分,是目前研究的热点,有望为瘢痕疙瘩的治疗提供新的突破口。Wnt/β-catenin信号通路是目前研究比较广泛的信号通路,参与调控细胞增殖、分化、凋亡和迁移等细胞生物学过程,其异常调控和疾病的发生密切相关[6]。β-catenin在该通路的信号传导过程中处于中心位置。当没有Wnt信号时,β-catenin在细胞质内被降解,维持在极低的水平。当Wnt信号激活时,β-catenin的降解复合体解散,导致β-catenin在细胞质内积累,随后进入细胞核,与T细胞因子/淋巴增强因子(T-cell factor/Lymphoid enhancing factor,TCF/LEF)转录因子结合,调控Wnt靶基因表达,产生生物学效应[7]。研究表明,Wnt/β-catenin信号通路的过度激活和瘢痕疙瘩的形成密切相关[8]。研究发现,β-catenin及其下游靶分子在瘢痕疙瘩和分离的成纤维细胞中都呈高表达状态[9]。抑制Wnt/β-catenin信号通路可以有效抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和胶原合成[10-11]。因此,鉴定具有抑制Wnt/β-catenin信号通路活性的中药单体成分,对于治疗瘢痕疙瘩具有重要的参考价值。桦木酸(betulinic acid,BA)是一种可从多种草本植物中提取出的羽扇豆烷型五环三萜类活性物质,其在桦树皮中的含量最高,具有抗肿瘤、抗菌、抗炎和抗纤维化等广泛的药理作用[12-13]。近年来,BA的生物活性及其治疗疾病的潜在价值受到国内外学者的广泛关注。本研究探讨BA对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成的调控作用,并探讨其可能的分子作用机制,为BA应用于瘢痕疙瘩的治疗提供初步的理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂 BA(分析标准品,HPLC≥98%)购自上海蓝木化工有限公司;细胞培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司;CCK-8试剂盒、EdU试剂盒、TOPFlash报告基因质粒、Lipo8000转染试剂和萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自上海翌圣生物科技股份有限公司;Trizol总RNA提取试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司;cDNA合成试剂盒PrimeScript RT reagent Kit和定量PCR试剂盒TB Green Fast qPCR Mix购自大连宝生物工程有限公司;蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和ECL发光试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;兔抗人Col Ⅰ抗体、β-catenin抗体、c-myc抗体、cyclin D1抗体和GAPDH抗体自武汉三鹰生物技术有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司 ......