王效德 后晓超 李青青 司玉婷 周小平 徐桂萍

    1 材料与方法

    1.1 材料 小鼠海马神经元细胞HT22(普诺赛公司);瑞马唑仑(恒瑞医药);2-ME2(HIF-1α抑制剂)(MCE公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(索莱宝公司);HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗体、羊抗兔二抗(CST公司)。

    1.2 细胞培养 HT22细胞置于含有10%胎牛血清DMEM培养基中,在37℃,含有5% CO2的环境下进行培养。

    1.3 OGD/R诱导[7]HT22细胞弃去培养液,用高压PBS清洗2遍后加入不含血清的DMEM培养基,后将细胞在含有1% O2、5% CO2、94% N2的培养箱中培养6 h,导致HT22细胞缺氧。6 h后进行复氧,弃掉不含血清培养基,重新加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,含5% CO2的培养箱中进行培养。

    1.4 筛选瑞马唑仑作用浓度 将OGD/R诱导的HT22细胞根据参考文献[8]用不同浓度的瑞马唑仑进行处理,24 h后加入MTT试剂,放回温箱继续孵育4 h,4 h后吸除上清,加入DMSO溶液,孵育10 min后,酶标仪在570 nm的波长下测量光密度(OD),细胞存活率=(OD处理组/OD对照组)×100%。

    1.5 细胞分组 将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、瑞马唑仑组、2-ME2(HIF-1α抑制剂)组、瑞马唑仑+2-ME2组。对照组不做处理,正常培养;OGD/R组进行OGD/R诱导;瑞马唑仑组进行OGD/R诱导并加入50 μg/mL瑞马唑仑;2-ME2组进行OGD/R诱导并加入0.5 μmol/L 2-ME2[9];瑞马唑仑+2-ME2组进行OGD/R诱导并加入50 μg/mL瑞马唑仑和0.5 μmol/L 2-ME2 ......