陈馨媛

    (中山大学附属第七医院 广东 深圳 518107)

    1 实验材料

    1.1仪器

    二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；MINI4-UVF超纯水仪(湖南科尔顿)；电热恒温水浴锅(天津泰斯特)；TGL 20M台式冷冻高速离心机(长沙英泰)；倒置式生物显微镜(重庆奥特光学)；Infinite M200 Pro多功能酶标仪(Tecan，瑞士)；二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)。

    1.2药品与试剂

    人肺癌细胞A549、人肝癌细胞 BEL-7402、人高转移性肝癌细胞 MHCC97H 细胞。RPMI-1640 培养基(Gibco，美国)；DMEM 高糖培基(Gibco，美国)；胎牛血清(FBS，BI，以色列)；0.25% EDTA 胰蛋白酶(Gibco，美国)；磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone，美国)；双抗(Solarbio，北京)；细胞冻存液(Solarbio，北京)。

    2 研究方法

    2.1 细胞毒性试验

    胰酶消化对数生长细胞，计数并调整细胞浓度为1×105/ml，100μl/孔吸取细胞悬液至96孔板中，培养箱中培养12h，吸弃培养基并用PBS清洗，加入培养基或含有不同浓度MTX的培养基(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μM)，培养箱中继续培养24h。每孔中加入10μlCCK8溶液，继续培养4h，终止培养。酶标仪在450nm处检测吸光度值(OD)。分析MTX对细胞增殖的影响。

    2.2 细胞内多聚谷氨酸化MTX (MTX-PGs)浓度测定

    2.2.1细胞样本提取

    按2.1处理细胞并铺与6孔板中 ......