妥舒沙星人体血药浓度测定及药代动力学研究(2)
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3.精密度及回收率 配制浓度为低、中、高(32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1、1296 ng•ml-1)的妥舒沙星标准血浆各5份，按样品处理方法平行操作，得日内相对标准差(RSD)分别为 2.5%、2.4%和1.4%，平均相对回收率分别为107.7%、95.6%和107.3%(表1)；连续测定3天，得日间相对标准差(RSD)分别为 4.3%、2.8%和2.8%(表2)。
4.萃取回收率 配制浓度为低、中、高( 32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1和1296 ng•ml-1) 的妥舒沙星标准血浆各5份，按样品处理方法处理进样，另用流动相配制相应浓度妥舒沙星溶液，不经处理直接进等量样品，以此为标准，两组峰面积之比值得妥舒沙星的萃取回收率分别为61.7%、90.2%和86.2%，内标加替沙星经同法处理得相应萃取回收率为93.3%。见表3。
5.稳定性考察
(1)血样的室温稳定性 配制低、中、高(32.4 ng•ml-1、324 ng•ml-1和1296 ng•ml-1)的妥舒沙星标准血浆样品，室温放置，分别在0 h、4 h、8 h、12 h按样品处理方法处理进样，记录对照品及内标的峰面积。结果浓度的RSD为4.0%、8.5%、1.6%(表4)，结果表明低、中、高(32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1和1296 ng•ml-1)妥舒沙星血样在室温下12 h内稳定。
(2)血样的冻融稳定性 配制低、中、高(32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1和1296 ng•ml-1)的妥舒沙星标准样品，置-2℃ 冰箱冷冻，取出样品室温融解，然后再冷冻，反复3次，每次按样品处理方法处理，记录对照品及内标的峰面积。结果浓度的RSD为3.3%、7.0%、0.95%(见表5)，结果表明低、中、高(32.4 ng•ml-1、324 ng•ml-1和1296 ng•ml-1)妥舒沙星历经3次冻融后稳定。
6.人体药代动力学实验选择20名男性健康志愿受试者，年龄19～26岁，体重57～78 kg，身高166～183 cm,常规体检及生化检验结果证明肝肾功能正常，心电图正常，生活习惯良好，无异常既往病史。试验经伦理委员会批准，受试者试验前均签署知情同意书。受试者随机交叉服用试验制剂(甲苯磺酸妥舒沙星分散片，0.15 g/片，批号：20070708)和参比制剂(甲苯磺酸妥舒沙星片，0.15 g/片，批号：20070504)。受试者进清淡晚餐后禁食过夜(至少10小时)，于晨起空腹服药[单次服用2片受试制剂(T)或2片参比制剂(R)，用量0.3 g]第一周期试验于给药24 h后结束，经过7天洗脱时间后开始下一周期试验，方法同第一周期试验。服药前(0 h)及服药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h分别从肘静脉取血4 ml，肝素抗凝，分离血浆至-20 ℃保存。两制剂主要药动学参数见表6；血药浓度时间曲线见图4。
讨论
在血浆样品处理过程中，笔者比较了20%高氯酸、三氯乙酸和乙酸乙酯三种提取溶剂，发现采用20%高氯酸提取的血样色谱行为干净，无内源性杂质干扰，且血样中妥舒沙星的提取比例要高于三氯乙酸、乙酸乙酯。而比较提取后用40℃氮气吹干，流动相溶解进样与提取离心后直接进样的方法发现，后者提取效率更高。妥舒沙星为弱酸性化合物，在酸性环境中其主要以分子形式存在，有助于提高有机溶剂萃取率，实验中笔者比较了磷酸、1 mol•L-1盐酸两种酸化方式，发现以1 mol•L-1盐酸酸化效果最好，样品杂质少、提取率高。
在内标的选择上，实验前考察了培氟沙星、帕珠沙星、加替沙星等化合物[5,6]。在本文色谱条件下，培氟沙星和帕珠沙星的保留时间与妥舒沙星相差太远；且帕珠沙星的色谱行为较差，最终发现加替沙星色谱行为好，保留时间与妥舒沙星比较接近，且在样品提取条件下，萃取回收率高，故选择加替沙星为内标。
有文献[2]报道流动相选用甲醇乙腈0.05%H3PO4(pH=4.0)，但酸性越低，妥舒沙星色谱峰形差、易脱尾，经实验摸索采用20 mmol•L-1KH2PO4作为水相，确定流动相为甲醇乙腈20 mmol•L-1KH2PO4(15∶15∶70)(醋酸调pH至6.0)，妥舒沙星峰和内标峰分离完全，峰型好，不受内源性杂质峰干扰，妥舒沙星和加替沙星色谱峰也比较稳定，故选择此混合溶液为流动相。
高效液相色谱荧光法灵敏度高，干扰因素多[7]。人血清中某些氨基酸及其代谢产物本身具有荧光，可能会干扰妥舒沙星的测定，因此采用适宜的提取方法显得尤为重要。本实验采用经酸化采用20%高氯酸提〗取的方法简便易行，回收率高，收干扰因素少，符合实验要求。
本实验采用高效液相色谱荧光法测定血浆中妥舒沙星浓度的方法，具有较高的灵敏度和选择性，是体内药物分析常用的分析方法之一，能够满足本试验低浓度药物测定以及药物动力学研究的要求。
参考文献
[1]刘明亮.喹诺酮类抗菌药的概况与展望[J].国外医药抗生素分册，2001,22(1):1-4.
[2]李 勇，袁 洪，谭鸿毅，等.高效液相色谱法测定人体内血浆中的妥舒沙星[J] ......
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