人胰淀素对胆碱能神经元钾通道的影响
【摘要】人胰淀素(hAmylin)由胰岛-B细胞释放，对维护细胞的兴奋性起着重要作用，胆碱能神经元在阿尔茨海默氏病的发病中起关键作用。这一实验主要是观察hAmylin对大鼠胆碱能神经元钾通道的影响。全细胞膜片钳电压钳模式记录，在酶解分离的基底前脑神经元上进行，结果显示当钳制电压在-30和30 mV范围时，hAmylin可抑制全细胞外向钾电流，使用烟碱受体竞争性拮抗剂二氢-β-刺桐啶碱(DHβE)，可以阻断hAmylin的作用。这对于理解阿尔茨海默氏病的发病原因和机制非常重要。
【关键词】人胰淀素；神经元；膜片钳；钾通道
【中国分类号】R338.8【文献标识码】A【文章编号】1044-5511(2011)10-0067-01
【项目基金】:本研究课题获河南省教育厅基金(项目号：2011C180007)和漯河医学高等专科学校基金资助(项目号：2010-S01)
, 百拇医药
人胰淀素(hAmylin)是一个由37个氨基酸组成的胰多肽，其作用是维持细胞的兴奋性。基底前脑的布洛卡区斜角带核(The nucleus of the diagonal band of Broca ，DBB)是一个在学习和记忆过程中起着重要作用的区域。经测定在这一结构区域的神经元是胆碱能神经元，而阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要神经病理学特征，既是基底前脑胆碱能神经元的丢失和神经炎症性β—淀粉样肽(Aβ)斑块沉积。在这项研究中，通过检查人胰淀素对急性分离的大鼠基底前脑神经元钾通道的影响，来了解阿尔茨海默病的发病机理和寻求治疗方法。
1. 材料与方法：
在电生理记录中使用的所有化学药品均购自Sigma公司。hAmylin和DHβE溶解在去离子水中于- 70℃冰箱内保存。雄性SD大鼠被安放在22℃的饲养室内，并给予12:12 h光照昼夜循环。
手术过程：
, 百拇医药
雄性SD大鼠(出生后20-25天)麻醉后，被迅速断头取出脑组织，放在冰冷的人工脑脊液中，人工脑脊液内含有氯化钠140 mM，氯化钾2.5 mM，氯化钙1.5mM，氯化镁1.2 mM，HEPES10 mM和D -葡萄糖33 mM(pH值7.4)。脑组织被用震动切片机(VT 1000S，德国)，切成350微米厚脑片，脑片包含了DBB区域。脑片用0.02%的胰蛋白酶处理，温度控制在30 ℃，然后进行急性分离神经元的制备，用机械性吹打的方法将脑片分散成单个细胞，接种于多聚- L-赖氨酸(0.005%wt/vol)涂层的盖玻片上，放在倒置显微镜下观察和进行电生理记录。在整个手术过程中，细胞被用纯氧气泡连续供给。
电生理记录：
全细胞膜片钳记录在室温(20-22℃)下进行，实验数据被用Axopatch-700B放大器和Digidata1440A数据采集系统(Axon仪器)采集。记录电极(世界精密仪器公司)，用1.5mm直径薄壁玻璃微电极拉制(PC-10，Narishige科学仪器实验室，日本), 其电极阻抗约3-6 ΩM。电极管内液成分含140 mM的K - methylsulfate，10 mM EGTA，5 mM氯化镁，1 mM氯化钙，10 mM HEPES, 2.2 mM钠-ATP和0.3 mM钠-GTP(pH值7.2)。所有记录细胞均被用人工脑脊液以大约1毫升/分钟流速进行连续灌注，记录使用低通滤波2 kHz，高通滤波10 kHz。采集到得数据储存至计算机，用pCLAMP 10.0软件进行分析。
, 百拇医药
统计分析
实验结果表示为平均值±S.E.M。采用方差分析和Student’s t检验进行统计数据比较。P值小于0.05被认为具有显著性差异。
2.结 果
记录的56个细胞，为了测量细胞的最大电流活动，当全细胞记录模式建立后，所有细胞的膜电位被钳制在-80 mV，接近细胞膜的静息膜电位水平；然后，给予指令电位刺激从-110 mV 到+30 mV(20 mV/s的步距)，观察诱发细胞膜的通道电流。当指令电位在+30?mV时，对照组细胞外向钾电流的幅度为5.90.2 nA (n=14)；在细胞外灌流液中加入hAmylin(20 nM)，记录到的外向钾电流的幅度为3.8 ± 0.2 nA，hAmylin显著抑制全细胞的外向钾电流，外向钾电流的幅度降低了37.6 ± 3.5 %(n = 14，P <0.01)。另一组细胞当指令电位在+30mV时，其细胞外向电流的幅度为5.70.2 nA (n=14)，在细胞外灌流液中加入hAmylin(20 nM)同时，也加入烟碱型乙酰胆碱受体竞争性拮抗剂二氢-β-刺桐啶碱(DhβE, 20 nM)其外向电流的幅度为5.4 ± 0.1 nA，与对照组比较没有显著性差异(n = 14，P = 0.15)，说明DHβE(20 nM)阻断了hAmylin对DBB神经元外向钾电流的抑制作用。
, http://www.100md.com
3. 讨 论
阿尔茨海默氏病(AD)是一种渐进性记忆障碍、认知功能障碍和痴呆为特征的神经变性疾病，其病因迄今不明。但胆碱能神经元减少，是AD早期损害的主要因素。我们的实验表明，胰淀素影响胆碱能神经元电压依赖性钾电流，DHβE阻断了hAmylin抑制作用。已知乙酰胆碱依赖性钾通道IK(ACh)只发现于外周视网膜小动脉、窦房结心房肌及房室结细胞膜上[1][2]。IK(ACh)是配体依赖性通道电流，其活动与细胞膜上的ACh受体和细胞内G蛋白有关，Ach作用于烟碱受体离子通道复合体，使Ca2+进入细胞内，激活了钙离子依赖的钾离子通道。在中枢神经系统是否有同样机制，需要进一步的研究。
参考文献
[1]Voigt N, Rozmaritsa N, Trausch A, Zimniak T, et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2010;381(3):251-9.
[2]Mori A, Suzuki S, et al. Role of calcium-activated potassium channels in acetylcholine-induced vasodilation of rat retinal arterioles in vivo. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2011;383(1):27-34., 百拇医药(李宗明 李秀凤)
【关键词】人胰淀素；神经元；膜片钳；钾通道
【中国分类号】R338.8【文献标识码】A【文章编号】1044-5511(2011)10-0067-01
【项目基金】:本研究课题获河南省教育厅基金(项目号：2011C180007)和漯河医学高等专科学校基金资助(项目号：2010-S01)
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人胰淀素(hAmylin)是一个由37个氨基酸组成的胰多肽，其作用是维持细胞的兴奋性。基底前脑的布洛卡区斜角带核(The nucleus of the diagonal band of Broca ，DBB)是一个在学习和记忆过程中起着重要作用的区域。经测定在这一结构区域的神经元是胆碱能神经元，而阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要神经病理学特征，既是基底前脑胆碱能神经元的丢失和神经炎症性β—淀粉样肽(Aβ)斑块沉积。在这项研究中，通过检查人胰淀素对急性分离的大鼠基底前脑神经元钾通道的影响，来了解阿尔茨海默病的发病机理和寻求治疗方法。
1. 材料与方法：
在电生理记录中使用的所有化学药品均购自Sigma公司。hAmylin和DHβE溶解在去离子水中于- 70℃冰箱内保存。雄性SD大鼠被安放在22℃的饲养室内，并给予12:12 h光照昼夜循环。
手术过程：
, 百拇医药
雄性SD大鼠(出生后20-25天)麻醉后，被迅速断头取出脑组织，放在冰冷的人工脑脊液中，人工脑脊液内含有氯化钠140 mM，氯化钾2.5 mM，氯化钙1.5mM，氯化镁1.2 mM，HEPES10 mM和D -葡萄糖33 mM(pH值7.4)。脑组织被用震动切片机(VT 1000S，德国)，切成350微米厚脑片，脑片包含了DBB区域。脑片用0.02%的胰蛋白酶处理，温度控制在30 ℃，然后进行急性分离神经元的制备，用机械性吹打的方法将脑片分散成单个细胞，接种于多聚- L-赖氨酸(0.005%wt/vol)涂层的盖玻片上，放在倒置显微镜下观察和进行电生理记录。在整个手术过程中，细胞被用纯氧气泡连续供给。
电生理记录：
全细胞膜片钳记录在室温(20-22℃)下进行，实验数据被用Axopatch-700B放大器和Digidata1440A数据采集系统(Axon仪器)采集。记录电极(世界精密仪器公司)，用1.5mm直径薄壁玻璃微电极拉制(PC-10，Narishige科学仪器实验室，日本), 其电极阻抗约3-6 ΩM。电极管内液成分含140 mM的K - methylsulfate，10 mM EGTA，5 mM氯化镁，1 mM氯化钙，10 mM HEPES, 2.2 mM钠-ATP和0.3 mM钠-GTP(pH值7.2)。所有记录细胞均被用人工脑脊液以大约1毫升/分钟流速进行连续灌注，记录使用低通滤波2 kHz，高通滤波10 kHz。采集到得数据储存至计算机，用pCLAMP 10.0软件进行分析。
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统计分析
实验结果表示为平均值±S.E.M。采用方差分析和Student’s t检验进行统计数据比较。P值小于0.05被认为具有显著性差异。
2.结 果
记录的56个细胞，为了测量细胞的最大电流活动，当全细胞记录模式建立后，所有细胞的膜电位被钳制在-80 mV，接近细胞膜的静息膜电位水平；然后，给予指令电位刺激从-110 mV 到+30 mV(20 mV/s的步距)，观察诱发细胞膜的通道电流。当指令电位在+30?mV时，对照组细胞外向钾电流的幅度为5.90.2 nA (n=14)；在细胞外灌流液中加入hAmylin(20 nM)，记录到的外向钾电流的幅度为3.8 ± 0.2 nA，hAmylin显著抑制全细胞的外向钾电流，外向钾电流的幅度降低了37.6 ± 3.5 %(n = 14，P <0.01)。另一组细胞当指令电位在+30mV时，其细胞外向电流的幅度为5.70.2 nA (n=14)，在细胞外灌流液中加入hAmylin(20 nM)同时，也加入烟碱型乙酰胆碱受体竞争性拮抗剂二氢-β-刺桐啶碱(DhβE, 20 nM)其外向电流的幅度为5.4 ± 0.1 nA，与对照组比较没有显著性差异(n = 14，P = 0.15)，说明DHβE(20 nM)阻断了hAmylin对DBB神经元外向钾电流的抑制作用。
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3. 讨 论
阿尔茨海默氏病(AD)是一种渐进性记忆障碍、认知功能障碍和痴呆为特征的神经变性疾病，其病因迄今不明。但胆碱能神经元减少，是AD早期损害的主要因素。我们的实验表明，胰淀素影响胆碱能神经元电压依赖性钾电流，DHβE阻断了hAmylin抑制作用。已知乙酰胆碱依赖性钾通道IK(ACh)只发现于外周视网膜小动脉、窦房结心房肌及房室结细胞膜上[1][2]。IK(ACh)是配体依赖性通道电流，其活动与细胞膜上的ACh受体和细胞内G蛋白有关，Ach作用于烟碱受体离子通道复合体，使Ca2+进入细胞内，激活了钙离子依赖的钾离子通道。在中枢神经系统是否有同样机制，需要进一步的研究。
参考文献
[1]Voigt N, Rozmaritsa N, Trausch A, Zimniak T, et al. Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2010;381(3):251-9.
[2]Mori A, Suzuki S, et al. Role of calcium-activated potassium channels in acetylcholine-induced vasodilation of rat retinal arterioles in vivo. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2011;383(1):27-34., 百拇医药(李宗明 李秀凤)